[发明专利]一种新的单克隆抗体的制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更特别地，本发明涉及一种新的单克隆抗体的制备方法及用途，适合于大规模的制备能够识别天然抗原表位的单克隆抗体。

背景技术

单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，其在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用，在人类和动物的免疫学诊断方面至今仍有着无可替代的重要作用。

单克隆抗体技术的基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱导免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B淋巴细胞来承担。肿瘤细胞在体外培养条件下可以无限传代，是永久细胞。把小鼠的骨髓瘤细胞与经过免疫的小鼠脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种细胞的特性，一方面可以分泌特异性的抗体，一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力、可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。

免疫方法和筛选抗原是决定能否获得高亲和力、能识别天然抗原表位的单抗的重要因素。DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，这种核酸分子是一种细菌质粒，在克隆了特异性的基因以后，能在真核细胞中表达蛋白抗原，刺激机体产生特异性的体液免疫反应和细胞免疫反应。与其他免疫的方法相比，DNA疫苗具有以下优点：没有感染的风险；诱发针对天然蛋白表位的抗体，长期持续的免疫反应；便于构建具有协同作用的细胞因子疫苗；纯化容易，生产成本低，稳定性不受温度影响。DNA免疫存在的一个关键问题是如何提高DNA疫苗的免疫原性和体液免疫反应。当前主要的研究方向集中在优化DNA疫苗的本身构建、佐剂和接种方案和途径。

免疫动物的血清抗体效价评估和筛选能分泌特异性识别抗原的杂交瘤细胞需要高质量的抗原。利用原核和真核系统表达的重组蛋白存在着明显缺陷：大肠杆菌表达的蛋白不能被修饰和正确的折叠，筛选到的单抗往往不能识别天然结构的抗原；哺乳动物细胞表达蛋白实验周期长，产量低，成本高，一些蛋白较难表达例如转录因子。用来评价抗体滴度和筛选杂交瘤细胞的抗原的获得是限制单克隆抗体制备的瓶颈。

因此，需要开发简易的单克隆抗体免疫策略和筛选方法，以用于大规模的制备能够识别天然抗原表位的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的单克隆抗体的制备方法及用途。

在本发明的第一方面，提供一种筛选单克隆抗体的方法，包括：

(1)提供构建物1，该构建物1包括(5’→3’)：表达盒1，其包括(5’→3’)启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括(5’→3’)启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；

将构建物1转染(如瞬时转染)哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原，裂解细胞获得含有生物素化抗原的裂解液；

(2)提供构建物2，该构建物2包括(5’→3’)：表达盒3，其包括(5’→3’)启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括(5’→3’)启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因；

将构建物2免疫哺乳动物，取哺乳动物脾脏细胞制备杂交瘤细胞；

(3)将步骤(1)获得的含有生物素化抗原的裂解液与包被有亲和素的固相载体接触，从而生物素化的抗原被固定于固相载体；以该生物素化的抗原来筛选步骤(2)获得的杂交瘤细胞分泌的抗体，获得特异性抗所述抗原的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种制备生物素化抗原的方法，包括：

提供构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；

将构建物1转染哺乳动物细胞，表达获得生物素化的抗原。

在本发明的另一方面，提供一种制备抗体的方法，包括：提供构建物2，该构建物2包括：表达盒3，其包括启动子3、信号肽编码基因、GM-CSF编码基因、终止子；和表达盒4，其包括启动子4、信号肽编码基因、抗原编码基因；

将构建物2免疫哺乳动物，获得哺乳动物的免疫血清，其中包括抗所述抗原的多克隆抗体；或将构建物2免疫哺乳动物，获取哺乳动物的脾脏细胞，制备单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种评估抗体的效价的方法，包括：

提供构建物1，该构建物1包括：表达盒1，其包括启动子1、生物素连接酶BirA编码基因、终止子1；和表达盒2，其包括启动子2、AviTag编码基因、抗原编码基因、终止子2；