[发明专利]一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法。

背景技术

戊型肝炎在亚洲、非洲及中美洲等发展中国家是一种非常严重的传染病，是导致发病及病死的重要因素。在一些发展中国家戊型肝炎可占到急性病毒性肝炎的50％，孕妇死亡率高达20％。1986～1988年在我国新疆的爆发流行，造成二十万人发病，孕妇平均死亡率为13．46％。因此，加强对戊型肝炎的预防控制极为必要。戊型肝炎病毒（HEV）是一种经肠道传播的病原体，是一种无包膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，直径27～34nm，表面粗糙，不规则，在胞浆中装配，呈晶格状排列，可形成包涵体。HEV基因组全长约7.5kb，有3个开放性读码框(ORF)，分别为ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF2基因长约2kb，为主要的结构基因编码区，编码病毒衣壳蛋白(pORF2)，产物为分子量约76kDa的糖基化蛋白，其c末端约200个氨基酸范围内有多个重要的免疫抗原表位。目前较为普遍的分型标准将HEV分为四个主要基因型，即基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，其代表株分别为缅甸株、墨西哥株、美国株及中国株，各基因型在全球的地理分布有明显的差异。自2000年以来，Ⅳ型HEV已经成为在中国流行的主要基因型。

由于HEV不能在体外培养，目前无法制备HEV灭活病毒疫苗和减毒活疫苗，国内外研究多为基因重组疫苗，候选抗原肽多集中于ORF2区。有学者利用杆状病毒—昆虫细胞表达系统或汉逊酵母系统等真核系统成功表达了HEV重组蛋白，但真核表达系统存在表达量低、工艺复杂、成本高等问题。厦门大学等多家研发单位采用大肠杆菌原核表达系统，表达产物为包涵体，需要变性、复性等步骤，收率低、工艺复杂。

因此，现有戊型肝炎疫苗制备工艺有待于完善和发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达率高，工艺简单，制备成本低的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，包括以下步骤：

A，培养工程菌株，并制备基础培养基和补料培养基；

B，所述基础培养基经过灭菌处理后，接入所述工程菌株；

C，监测所述工程菌株的细菌细胞密度OD600，当所述OD600的值为40～80时，在基础培养基中加入诱导剂进行诱导；

D，当所述OD600的值至少提高百分之五时，进行收菌；

E，离心提纯后，即得P179蛋白；

在所述步骤B~D过程中，实时监测基础培养基中葡萄糖的含量，当葡萄糖的含量少于预定值时，增加补料培养基，使得葡萄糖的含量等于或大于所述预定值。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤A中的所述工程菌株为大肠杆菌HEV179/BL21(DE3)。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤A中的所述基础培养基的配方为：葡萄糖30~50g，酵母粉90~100g，蛋白胨200~250g，NaCl 80~100g，MgSO₄ 8~15g，消泡剂2~5ml，KH₂PO₄ 35~45g，Na₂HPO₄·12H₂O 120~150g，加蒸馏水定容至20L。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤A中的所述基础培养基的配方还包括微量元素 30~50 ml，所述微量元素的配方为：FeSO₄·7H₂O 0.1~0.2g，CaC1₂·2H₂O 0.025~0.05g，ZnSO₄·7H₂O 0.0225~0.05g，MnSO₄·H₂O 0.001~0.005g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.001~0.005g，Na₂B₄O₇·12H₂O 0.0002~0.0005g，CuS0₄·5H₂O 0.01~0.04g，CoCl₂·6H₂O 0.001~0.005g，加蒸馏水定容至1L。