[发明专利]一种糜蛋白酶的纯化工艺

说明书

技术领域    

本发明涉及生物制药技术中糜蛋白酶领域，特别涉及一种糜蛋白酶的纯化工艺。

背景技术   

糜蛋白酶是从牛胰脏或猪胰脏中提取分离纯化得到的一种蛋白酶。它能切断蛋白质肽链中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽链，故能有效酶解蛋白质，因而具有清创消脓，消化脓汁和去除坏死组织，助长新生肉芽生长的功能。在临床上主要用于抗炎消肿，有报道称其在辅助抗癌方面也具有不错效果。此外，在皮革工业上，糜蛋白酶常用于脱去动物皮上的毛等。

目前国内已对该酶做了大量的研究，提取纯化工艺多采用盐析多重结晶结合透析的方法。盐析多重结晶纯化能力弱，耗费时间长；低温激活耗费时间长，激活效率低；透析工艺耗时长，不便于工业化生产；且得到的产品纯度低，杂蛋白多，增加了用药的不良反应；传统工艺所得产品的酶活性一般在1000-1200单位/毫克左右，产品纯度为80-85%。酶活性低，产品中的杂蛋白增加了过敏反应风险。因此，提高糜蛋白酶的纯度，提高其活性可以提高该酶的用药安全性，是研究人员需关注的问题。

发明内容   

为了解决以上糜蛋白酶活性含量低，纯度低的问题，本发明提供了一种制得的糜蛋白酶活性含量高、纯度高的糜蛋白酶的纯化工艺。

本发明是通过以下方式实现的：

一种糜蛋白酶的纯化工艺，包括以下步骤：

（1）取牛胰，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成胰浆；

（2）向胰浆中加入硫酸溶液进行盐析，过滤；

（3）滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；

（4）过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；

（5）滤出液用截留分子量5-10kDa的超滤膜进行超滤；

（6）滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；

（7）过滤，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3-5倍，加硫酸调pH为2.0，搅拌使溶解，加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的2倍，调pH至5.0，25℃，孵育2-5 h，有晶体析出，过滤收集晶体；

（8）晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3-5倍，调节pH 7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4 h ；

（9）调节pH 至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；

（10）沉淀用冷纯化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；

（11）将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC 缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/L NaCl 的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl 的缓冲液洗脱得洗脱液；

（12）将上述洗脱液用截留分子量10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。

所述的纯化工艺，步骤（3）中滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，加入硅藻土助滤。

所述的纯化工艺，步骤（7）中用5N NaOH调节pH至5.0，加入的硫酸为5N的硫酸。

所述的纯化工艺，步骤（8）中胰蛋白酶加入量为5mg/100g晶体，加入晶体重量1倍的体积的pH 7.6、0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7.6。

所述的纯化工艺，步骤（10）中超滤时添加pH 3.0的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC 缓冲液电导相同为止。

冷纯化水是指10℃以下的纯化水。

本发明的有益效果：本发明的糜蛋白酶的纯化工艺，使用超滤膜与离子交换柱的结合来纯化糜蛋白酶，纯化效果好，得到的产品纯度高,降低了以往因产品中的杂蛋白而导致的过敏反应风险；本发明工艺得到的糜蛋白酶酶活性高，效价大于1500 U/mg，提高了该酶的用药安全性。

附图说明   

图1为实施例1所得产品HPLC检测纯度图。

具体实施方式

实施例1

（1）取新鲜牛胰10 kg，去除脂肪、结缔组织等，用绞肉机绞碎成胰浆；

（2）加入20L（胰浆体积量的2倍）0.25 N硫酸溶液，于冷室中搅拌提取24h，过滤，滤饼用10 L冷的0. 25 N硫酸同法搅拌提取1h，过滤，合并两次滤液；

（3）滤液搅拌并逐渐加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中低温放置过夜；