[发明专利]一种糜蛋白酶的纯化工艺

权利要求书

1.一种糜蛋白酶的纯化工艺，其特征在于包括以下步骤：

（1）取牛胰，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成胰浆；

（2）向胰浆中加入硫酸溶液进行盐析，过滤；

（3）滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；

（4）过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；

（5）滤出液用截留分子量5-10kDa的超滤膜进行超滤；

（6）滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；

（7）过滤，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3-5倍，加硫酸调pH为2.0，搅拌使溶解，加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的2倍，调pH至5.0，25℃，孵育2-5 h，有晶体析出，过滤收集晶体；

（8）晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3-5倍，调节pH 7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4 h ；

（9）调节pH 至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；

（10）沉淀用冷纯化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；

（11）将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC 缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/L NaCl 的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl 的缓冲液洗脱得洗脱液；

（12）将上述洗脱液用截留分子量10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。

2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤（3）中滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，加入硅藻土助滤。

3.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤（7）中用5N NaOH调节pH至5.0，加入的硫酸为5N的硫酸。

4.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤（8）中胰蛋白酶加入量为5mg/100g晶体，加入晶体重量1倍的体积的pH 7.6、0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7.6。

5.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤（10）中超滤时添加pH 3.0的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC 缓冲液电导相同为止。