[发明专利]一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列的一对引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针，TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基因，3’端标记有淬灭荧光基团。

2.根据权利要求1所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述TaqMan探针的5’端标记的荧光报告基因为FAM，3’端标记的淬灭荧光基团为Tamara。

3.根据权利要求1所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒中还包括PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品。

4.根据权利要求3所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒组成为：

TaqMan探针引物混合液1管：浓度为5μM的TaqMan探针、浓度为10μM 的SEQ ID NO:1所示引物和浓度为10μM 的SEQ ID NO:2所示引物按体积比为1:1:1组成的混合液；

TaqMan Mix 1管：10×PCR反应缓冲液、25mM的dNTP和10U 的DNA聚合酶以及酶稀释液按体积比为25:4:5:1组成的混合液；

阳性质控品1管：浓度为0.5ng/μL的羊口疮病毒ORFV024基因片段样品；

阴性质控品1管：0.01M PBS；

无菌水1管。

5.根据权利要求3所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒实时荧光定量PCR反应体系为25μL，其中5μM的TaqMan探针1μL，10μM的上、下游引物各1μL，样品DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mM的dNTP 0.4 μL，10 U DNA聚合酶0.5 μL，0.1μL酶稀释液，无菌水补足到25μL；或按照上述比例配制。

6.权利要求1~5任一所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于实时荧光定量PCR反应条件为： 95℃ 10min；95℃ 15s，58℃ 45s，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

7.根据权利要求6所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于先用不同稀释度的含羊口疮病毒ORFV024基因片段样品作为标准品进行实时荧光定量PCR，以ORFV024基因片段拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，再将待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测结果。

8.根据权利要求7所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于所述含目的基因片段样品为含有ORFV024基因片段的质粒；所述ORFV024基因片段是以SEQ ID NO:4~5所示核苷酸序列为引物，以羊口疮病毒基因组DNA为模板扩增得到的。

9.根据权利要求7所述羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于稀释浓度分别为：1.06×10⁸copies/μL； ②1.06×10⁷copies/μL；③1.06×10⁶copies/μL；④1.06×10⁵copies/μL；⑤1.06×10⁴copies/μL；⑥1.06×10³copies/μL；⑦1.06×10²copies/μL；⑧1.06×10¹copies/μL；⑨1.06×10⁰copies/μL。