[发明专利]结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病原生物学、分子微生物学和核酸化学领域，涉及一种新型的基因点突变检测探针的设计方法和序列，以及其在结核分枝杆菌利福平耐药突变检测中的应用，这种方法可以直观快速并可视化的检测结核分枝杆菌利福平耐药突变。

背景技术

由结核分枝杆菌引起的结核病(Tubercu1osis，简称TB)是一种古老的疾病，在很早以前就在世界广泛传播，20世纪50年代以来，异烟肼、利福平等有效治疗结核药物的发现，大大提高了结核病治愈率，并降低了结核病的复发率，使结核病成为一种可治愈和控制的疾病。在一些发达国家，结核病已基本得到控制。然而近些年来，由于一些国家对结核病防治工作的忽视，结核病的防治不能获得预期效果；很多地方结核病化疗方案不合理，管理不善，缺乏监控，造成结核分枝杆菌耐药菌株，特别是耐多药菌株的产生和传播，加大结核病治疗的难度，加剧结核病疫情的恶化；加上艾滋病的流行以及经济全球化造成的人口广泛流动，促使结核病卷土重来，重新成为全球紧迫的公共卫生问题。到了20世纪90年代，结核病疫情在世界的许多地方已经失控，全球三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新发结核病人约为800～1000万，每年约有300万人死于结核病。中国结核病的疫情同样严峻，呈现患病率高、死亡率高、耐药率高、年递减率低的“三高一低”的势态。当前我国是全球22个结核病高负担国之一，结核病人总数仅少于印度，是全世界患者第二多的国家。面对这样的形势，科研工作者需要发展新的诊断技术和治疗药物，解决结核病防治中的棘手问题。

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)也常简称为结核杆菌或结核菌，是结核病的致病菌。结核分枝杆菌耐药主要是由于基因组中药物靶基因随机突变造成的。目前使用的一线抗结核药物主要包括利福平和异烟肼，其中利福平在细菌中的靶蛋白为RNA聚合酶的β亚基，利福平与RNA聚合酶的β亚基结合，阻碍mRNA合成，抑制转录过程，阻断细菌的蛋白质合成，达到抑菌的作用。研究表明结核分枝杆菌利福平耐药通常由其RNA聚合酶β亚基编码基因rpoB突变所致，这些突变大部分(90％以上)位于一个81bp的区域，称之为RFP耐药决定区(Rifampicin Resistant Determination Region，RRDR)。

目前耐药结核分枝杆菌检测的方法主要是培养法，但结核分枝杆菌生长缓慢，需要4～8周才能给出结果，而且阳性率不高，仅为30％～40％，导致很多结核病人得不到及时诊治。而基因突变和结核分枝杆菌耐药性之间具有相关性，因此很多研究者发展各种突变检测的方法，通过检测相关的基因突变来检测结核菌耐药。目前研究者用于检测结核分枝杆菌耐药突变的方法包括分子信标和反向探针杂交，但这两种方法操作较复杂，且需要专门的仪器。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足，提供一种针对耐药结核分枝杆菌检测的可视化检测探针，用于结核病利福平耐药突变的可视化检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针，其包括：

锚定探针，其3’端含有3段GGG序列参与G-四链体形成，或其3’端含有1段GGG序列参与G-四链体形成；

竞争探针，其互补区与野生型靶序列完全互补，所述野生型靶序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；

突变检测探针，其互补区与相应的突变型靶序列完全互补，其5‘端具有1段GGG序列参与G-四链体形成，或其5‘端具有3段GGG序列参与G-四链体形成；

所述锚定探针的互补区与靶序列上的与检测探针互补区段的下游互补，所述锚定探针与检测探针在结合在相应的突变型靶序列上时，两者之间能够形成G-四链体；

在对靶序列PCR产物进行检测时，为防止发夹结构影响探针与靶核酸的结合，其还包括一对绝缘探针，所述绝缘探针分别结合在锚定探针结合区域的下游和突变检测探针结合区域的上游。在反应体系中加入这两个探针能与探针(锚定探针和突变检测探针)在靶核酸结合区域的旁侧区域互补，和单链靶核酸形成稳定的双链，从而打开靶核酸形成的发夹结构，有利于突变检测探针与靶核酸的结合。

针对耐药结核分枝杆菌检测，本发明选用结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚基编码基因rpoB为目的基因，主要集中于其利福平耐药决定区，这段区域负责编码相当于大肠杆菌RNA聚合酶β亚基507位至533位，共27个氨基酸(黄海荣，金奇，马玙，陈曦，李惠文，庄玉辉.中国耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特点.中华结核和呼吸杂志，2001，24(4)：231～235)。