[发明专利]黄牛WNT10B基因的单核苷酸多态性位点及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛WNT10B基因内含子1及外显子2、4、5的单核苷酸多态性的检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

脂肪组织不仅是重要的能量贮库和赋形组织，还是保持内环境稳定的重要内分泌器官。动物体内存在棕色和白色两种脂肪。白色脂肪堆积在皮下，负责储存多余热量；棕色脂肪负责分解引发肥胖的白色脂肪，将后者消耗，加快新陈代谢。

WNT10B(wingless-type MMTV integration site family，member 10B，WNT10B)是Wnt蛋白家族19个成员之一，该蛋白家族主要负责调节胚胎发生的复杂过程，其中也包括脂肪组织的形成。WNT10B能够抑制脂肪沉积包括白色脂肪组织发育以及棕色脂肪生成。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛WNT10B基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

黄牛WNT10B基因单核苷酸多态性位点，其中，该基因单核苷酸多态性包括：