[发明专利]一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高山植物基因组DNA提取的方法，属于基因工程技术领域，具体的说涉及一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法。

背景技术

由于高山植物环境条件恶劣，所以高山植物通常被认为是陆地上最为极端的生物，但是高山植物却也拥有丰富极具价值的基因资源。自1896年以来，作为生物进化研究中的热点和难点，高山和极地植物对生境的适应机制和策略一直倍受研究者们的关注。高山植物基因组DNA的提取技术是进行植物分子生物学研究的基本技术之一，DNA产率的高低，质量的好坏直接影响到后续实验的成败。探讨高山植物基因组DNA的提取方法是一项非常有意义的工作，为确保在农作物环境胁迫抗性育种方面提供优异种质和选择指标、为农业基础研究与基因工程提供相关基因。将这种特殊的基因资源应用在观赏陆地植物，将保护与合理利用有效结合，走人与自然和谐发展的可持续性发展道路，这不仅有利于该区域植被的生长发育、生态系统的稳定，更有利于地区经济的发展。

高山植物的基因组提取方法有多种，近年来，人们一直致力于研究一种高效快速的提取方法，但是由于物种的特异性，高山植物的基因组提取起来并不是那么方便，。高山植物生存的环境温度低，辐射强，在这样的环境中，植物生长极其缓慢，产物消耗减少，为提高其抵御寒冷和生理干旱方面，使部分糖分和脂类物质积累并储存于叶片组织细胞中，使得高山植物基因组DNA的提取难度加大。王卓伟，等在对桑叶DNA提取方法研究过程中发现PVP还能有效地去除多糖。罗志勇等在研究中对这种方法进行了几点改进:①提高CTAB的浓度;②对于含多酚类较多的植物，增加CTAB提取缓冲液中?-巯基乙醇的含量，同时加入PVP使其与多酚类物质结合形成复合物；③增加低盐沉淀缓冲液的量;④增加高盐溶液中盐的浓度。用改进的方法从人参、西洋参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的DNA; Porebski,等在沉淀粗提 DNA时，将提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至2.5 mol·L^-1以使DNA在高盐缓冲条件下优先沉淀，可更有效地除去多糖。余志雄对火龙果总DNA提取方法比较研究验证了CTAB法对火龙果基因组提取是有效，而且应雄美对两种不同甘蔗基因组DNA提取方法的比较，同时证明了SDS和CTAB法都能提取到基因组DNA并且对两种方法进行了改进。

长白山杜鹃是一种有代表性高山植物，在海拔1700 m-2500 m海拔带均有分布，其生理生化指标较为特殊，关于本研究中提到的长白山杜鹃基因组提取的方案也有多种，但是不同方法对不同植物的基因组提取效果大不相同。对于杜鹃的基因组DNA提取方面的研究还是很少的。赵喜华，等以杜鹃属常绿杜鹃亚属井冈山杜鹃树叶为材料分别采用CTAB法、碱裂解法、SDS法提取杜鹃基因组DNA，三种方法所提取的DNA纯度及产率有差别，其中CTAB法较好。庄得凤,曹后男,采用CTAB法（①取0.2 g 左右研磨好的新鲜叶片置于1.5 mL 离心管中, 加800 ul 经65℃预热的CTAB ( 2% CTAB; 100 mmol·L^- 1 Tris -HCl , pH8.0；20 mmol·L^- 1 EDTA；1.4 mol·L^- 1 NaC1；2% PVP ) 提取缓冲液, 研磨前加入2% β- 巯基乙醇；充分混匀后, 在水浴锅中65℃温浴1h；等）提取几个品种长白山杜鹃的基因组DNA, 所得的DNA 纯度高、质量好，但是牛皮杜鹃及孢叶杜鹃基因组未能提取出来。本实验用SDS法提取植物基因组（魏群.分子生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2007.）的方法：“取0.2g新鲜植物叶片，在液氮中研磨成粉末状；转移至2 mL离心管中，加入800 ul细胞提取液（pH 8.0，100 mmol·L^-1 Tris·HCl, 5 mmol·L^-1 EDTA, 500 mmol·L^-1 NaCl, 1.25% SDS, 100 ul β-巯基乙醇 ），充分混匀；65^oC水浴保温20分钟; 从水浴中取出离心管，加入250 ul 5 mol·L^-1 KCl溶液，混匀，冰浴20分钟；等”来提取长白山杜鹃的基因组，未能成功提取出其基因组DNA。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于克服现有技术对长白山杜鹃基因组DNA提取方法中，基因组提取困难、纯度低、易降解的不足，提供一种新的长白山杜鹃基因组DNA提取的方法，从而获得纯度高、稳定性强的长白山杜鹃基因组DNA。