[发明专利]一种表达人抗体全基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域。本发明涉及利用重组腺相关病毒(rAAV)载体高效表达人抗体全基因的技术平台。在具体应用中将不限于本研究中所使用的载体及抗体基因。

背景技术

抗体(Antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，抗体具有特异性强、副作用小、免疫原性低、生物活性单一等特点，由于其独有的特征已迅速应用于生物学和医学的很多领域。目前世界上有30多个抗体药物已经获得批准上市，主要集中在肿瘤、自身免疫性疾病和感染类疾病等方面。目前应用的抗体药物的种类主要有鼠源性抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体，鼠源性抗体由于能够诱发人体产生人抗鼠抗体、半衰期短，引起过敏反应和超敏反应等缺点，影响其在肿瘤、器官移植等疾病和的诊断和治疗上的应用。人-鼠嵌合抗体和人源化抗体由于与抗原的结合能力弱，长时间使用能诱发人体产生人抗鼠抗体也是其应用受到限制，而人抗体具有更低的免疫原性、更好的安全性、更慢的清除周期，目前抗体药物的发展主要方向是向全人抗体发展，有的抗体在临床治疗比较成功，但对于抗体的广泛应用还是受到生产能力的限制，提高抗体全基因的表达效率，包括在体内的基因治疗和体外哺乳细胞的大量表达等方面都将产生重要的意义。

当前，我国表达载体和细胞株改造都远远落后于欧美国家，所以治疗性抗体药物重点解决的问题之一是建立高效表达抗体基因的载体。抗体的基本结构相似，都是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)通过二硫键连接而成，将重链和轻链构建在载体上进行高效的表达是关键所在，这样就涉及到双基因共表达的构建策略。双基因共表达的构建策略主要有以下几个方面：(1)双启动子的构建策略，这种策略是用双表达盒表达两个基因，用各自独立的启动子转录不同的基因，启动子可以一样也可以不一样，载体上有两个启动子和两个PolyA。这种构建策略的缺点是内部启动子占用了载体上有限的克隆空间，为了增加克隆空间可以用两个启动子和一个PolyA的构建方案，这两种方案在不同的载体中转录效果也不尽相同。真核载体常用的启动子有CMV、EF-1α、hPGK、CAG、mPGK等，不同启动子有不同的转录效率，同时在不同组织中转录的效率也不尽相同；(2)引入IRES的构建策略，两个基因之间插入内核糖体插入位点(internal ribosomal entry site，IRES)序列使其为同一启动子驱动而转录为单个mRNA，但翻译为两种不同的蛋白质。这种构建方案能够避免双启动子转录时的相互干扰，但置于IRES下游基因表达量远远比上游基因表达量的效率低很多；(3)融合表达的构建策略，用连接肽(linker)将两个基因相连，在一个启动子调控下翻译出具双功能的融合蛋白分子，但对于抗体来说需要轻、重链分别表达才能组装成功能和立体结构完整的IgG。除此之外还有供体/受体位点剪切构建策略、Furin切割构建策略、2A序列自我切割构建策略等，这些构建策略由于在体内切割效率低，两基因的表达效率也很不稳定，还有部分剪切的调节机制还都不清楚。

腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型病毒，是一种安全有效的基因转移载体，在正常细胞中并不发生产毒性感染，其载体中不含任何AAV的结构基因，载体基因组中含有的唯一病毒序列是非编码的反向末端重复序列(ITR)，因而转导后不合成天然的病毒蛋白，目前rAAV2已用于多种人类疾病的基因治疗研究。现在各种血清型AAV载体都是在2型AAV(AAV2)基础上改造的“杂合”载体，即使用AAV2的ITRs以及全部或部分AAV2的Rep基因，换上其他血清型AAV的Cap蛋白。AAV2/1载体具有AAV2的ITR和AAV1的外壳，其具有野生型AAV1病毒的细胞亲嗜性、感染特性。实验结果表明，AAV2/1载体转导骨骼肌的效率明显高于AAV2载体，外源基因的表达水平高10倍以上，表达时间也明显提前。将AAV2/1载体进行肌肉注射后，实验中可以明确地观察到目的基因的表达范围比AAV2更宽，甚至扩散到整块肌肉。AAV作为载体具有安全性好、宿主范围广、物理性质稳定、易于运输和保存、可长期稳定地表达外源基因等这些特点，使用重组AAV载体表达抗体全基因用于基因治疗和疫苗研究等方面具有很好的前景。