[发明专利]截短的细粒棘球蚴EG95蛋白重组毕赤酵母高密度发酵工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组酵母的发酵工艺，确切讲本发明涉及一种截短的细粒棘球蚴EG95蛋白的tEG95重组毕赤酵母高密度发酵方法。 

背景技术

棘球蚴病(Echinococcosis)又称包虫病(Hydatid disease)，是对人畜危害极为严重的人畜共患寄生虫疾病。该病呈世界性分布，我国是包虫病发病最高的国家之一。在我国以囊型包虫病(cystic echinococcosis，CE)为主。CE对人畜危害极为严重，人可因误食虫卵感染该病，在肝、肺等器官形成占位性病灶。各种动物(包括人)都可因囊泡破裂而产生严重的过敏反应而突然死亡。该病可导致我国畜牧业每年直接经济损失达30多亿元，造成严重的经济损失，严重威胁我国流行区农、牧民身体健康和畜牧业的发展，是“健康中国2020行动计划”规划防治的五大寄生虫病之一。由于对中间宿主接种疫苗可控制包虫病的流行，因此通过免疫预防途径控制和消灭包虫病是一项有效的措施和较为理想的途径。 

研究证实，棘球绦虫六钩蚴分泌抗原具有较好的保护作用，但无法使其在体外培养中大量增殖，抗原来源量有限，限制了其在免疫预防中的广泛应用。如何找到一种可大量增殖棘球绦虫六钩蚴分泌抗原是现阶段的要解决的问题。 

发明内容

本发明提供对重组的细粒棘球蚴EG95蛋白进行高效表达的高密度发酵方法以大量增殖并获得棘球绦虫六钩蚴分泌抗原，特别是一种对截短的细粒棘球蚴EG95蛋白的tEG95重组毕赤酵母进行高密度发酵方法。 

本发明上述内容是通过以下技术方案来实现：挑取1个重组酵母工程菌单克隆EG95-1到YPD液体培养基中，培养至菌液OD₆₀₀为5.0左右，得到一级种子培养液；再将上述培养液转接BMGY培养基，培养至菌液浓度OD₆₀₀达到40.0左右，得到发酵工作种子液，上述培养过程均在28℃下进行。本发明所使用的重组酵母工程菌单克隆EG95-1菌株系发明人构建并鉴定，并于2012年02 月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No5764(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No5764，分类命名：巴斯德赤毕酵母(Pichia pastoris)。 

本发明的截短的细粒棘球蚴EG95蛋白(tEG95)重组毕赤酵母高密度发酵方法是将由前述的将发酵工作种子液按1∶10的体积比转接于2000mL BSM液体培养基，调整培养基pH到5.5开始增菌，增菌过程补加含50％(W/V)甘油和1.2％(V/V)PTM1的水溶液的补料1溶液，待菌液OD₆₀₀达到90.0左右，即重组酵母菌湿重达到140mg/mL左右，停加补料1溶液并继续培养至耗尽甘油(，此时菌液OD₆₀₀约为72.00，湿重约为150mg/mL)，再在培养体系中分阶段加入含1.2％(V/V)PTM1的甲醇溶液的补料2溶液进行蛋白诱导表达，第一阶段的补料2的补加流速为10mL/h，补加3h，停加补料2约1h，至诱导后4h；第二阶段的补料2的补加流速为15mL/h，补加5h，停加2h，至诱导后11h；第三阶段的补料2的补加流速为20mL/h，补加10h，停加3h，至诱导后24h；第四阶段的补加流速为25mL/h，补加72h，至诱导后96h，整个发酵过程的温度均为28℃。 

相关研究表明，EG95蛋白具有良好的免疫保护作用，可以通过基因工程技术生产。在现有的真核表达系统中，毕赤酵母表达体系具有几大优势，包括可以在高细胞密度发酵罐培养基培养，蛋白表达成本低，蛋白表达量高，蛋白可以分泌表达，表达蛋白纯度高，也易于纯化，并且可以使外源蛋白在发酵罐中的表达水平比普通摇瓶提高10～100倍，完全可以满足大规模生产的需要。我们的相关发明中首次在酵母表达系统内对EG95蛋白进行了分泌表达。本发明主要提供一种对表达EG95目的蛋白的重组毕赤酵母进行高密度发酵的工艺，这为细粒棘球蚴EG95基因工程疫苗的大规模生产和最终应用奠定了基础。 

本发明中所用的重组毕赤酵母为重组了细粒棘球绦虫EG95蛋白基因的毕赤酵母。经相关文献检索发现，本发明为首次用重组毕赤酵母菌在发酵罐内对细粒棘球绦虫EG95蛋白进行发酵表达。本发明的蛋白表达过程具有操作简单，蛋白表达成本低，蛋白可溶性表达，蛋白表达量高的优点。其目的蛋白在发酵上清液中的浓度高达4.62g/L。 

附图说明