[发明专利]一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒，通过同时检测与肝癌关联的基因MICA和HLA-DQ的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患肝癌的风险性。

背景技术

肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。随着人类在基因方面的不断深入研究，先已发现了两个与肝癌相关的风险基因，分别是MICA和HLA-DQ。

MHC-I类链相关基因（Major histocompatibility complex class I chain-related gene，MIC）定位于人类第6号染色体MHC-I类基因区域，包括MICA、MICB、MICC

、MICD、MICE、MICF和MICG，其中仅MICA、MICB为功能基因，可编码功能蛋白，其它5种均为假基因。

    MICA基因编码的蛋白产物属于膜蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞浆区。MICA的表达具有组织特异性，研究发现MICA蛋白仅表达于新鲜分离的内皮细胞、成纤维细胞和胃肠道上皮细胞表面。在各种变异细胞，特别是上皮细胞来的肿瘤细胞中MICA分子的表达可发生上调。病毒感染、受热等也会引起MICA表达的变化，因此MICA被认为是一种应激性蛋白。NKG2D（the actiating killer cell lectin-like receptor K ，NKG2D）是MICA的受体，可表达于多种免疫细胞，在NK、γδ⁺T细胞和CD8⁺T细胞介导的对肿瘤和感染的免疫反应中起重要作用，参与适应性及固有性免疫应答。

    MICA已被发现在多种肿瘤中出现高表达，如乳腺癌、肺癌、消化道肿瘤、前列腺癌等，并且这些肿瘤中会出现高水平的γδ⁺T细胞浸润，γδ⁺T细胞通过识别MICA分子对表达MICA的细胞有较强的细胞毒作用，这种肿瘤免疫监视机制在早期对抗肿瘤有一定积极作用。Wagsater等研究了直肠癌中MICAmRNA的表达水平，发现直肠癌中MICA的表达水平增高，提示MICA可能是免疫系统实施免疫监视的效应分子之一。免疫系统通过MICA与NKG2D的结合，激活NK等免疫细胞以清除肿瘤细胞。

    人类MHC主要为人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），分为Ⅰ类和Ⅱ类。MHCⅡ类分子只在少数细胞表达，如树突状细胞、B淋巴细胞等，其中最具代表性的为HLA-DR和HLA-DQ抗原。HLA-DR，-DQ通过MHCⅡ类分子限制的T细胞对外来抗原的识别，在介导淋巴细胞活化、抗原递呈等机体免疫应答和免疫调节过程中发挥重要的作用。

    经过研究，我们认为HLA-DR和-DQ在肝癌组织中的表达机制有一下可能：（1）肝癌细胞中有明显的低甲基化和局部高甲基化，Ⅱ类分子表达主要受Ⅱ类反式激活因子（Class Ⅱ trans – activator，CⅡTA）的调控，CⅡTA启动子由DNA甲基化调控，使用5-aza-CdR处理后或传染CⅡTA基因均可诱导上述瘤细胞MHCⅡ的表达，并使瘤细胞恢复抗原处理和递呈的功能，而达到增强CTL和抗体依赖的特异免疫反应的目的。在人类肿瘤中，如绒癌、白血病、T细胞来源的恶性肿瘤以及视网膜母细胞均缺乏MHCⅡ的表达，其机制也与CⅡTA的高甲基化有关。（2）肿瘤组织刺激机体产生炎症反应，浸润型T细胞释放多种细胞因子，这些细胞因子有诱导肿瘤细胞表达HLA-DR等。IFN-γ等多种细胞因子对血源性或非血源性的组织都能够诱导其表达HLAⅡ类分子，但提前是CⅡTA基因必须是未甲基化的。在我国HCC多数伴有HBV感染,因此在慢性肝炎、肝硬化及肝癌这个发展过程中，CⅡTA基因发生不同程度的低甲基化，在炎症细胞释放的细胞因子的诱导下，肝癌细胞发生不同程度的HLA分子的表达。

    总之，正常肝细胞中是不表达或弱表达的，在肝癌细胞中HLAⅡ类分子的表达可能是按照上述两个可能的顺序发生的。首先是要有CⅡTA启动子去甲基化，然后由IFN-γ等细胞因子提供促进HLA表达的信号。

发明内容

基于MICA基因、HLA-DQ基因上的2个SNPs位点多态性可用来评估个体罹患肝癌风险性的基础上，本发明提供一种检测肝癌相关风险基因的试剂盒。

试剂盒包括：