[发明专利]焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

伊立替康系喜树碱类前药，在体内可经羧酸酯酶代谢成活性形式7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)。SN-38作用靶点是DNA拓扑异构酶I，可干扰DNA复制和转录，可抑制DNA合成，具有较强杀伤肿瘤活性。广泛应用于胃癌、结直肠癌、肺癌等实体瘤治疗，可显著提高患者总生存期。但伊立替康治疗时，严重的毒副反应发生率较高，特别是可导致严重的延迟性腹泻和粒细胞缺乏，使其临床应用受到影响。临床研究表明，40％以上接受伊立替康治疗的患者可出现3～4级迟发性腹泻，约10％患者可出现嗜中性白血球减少症，从而导致化疗方案提前中止。SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT1A1)葡萄糖醛酸化灭活，生成葡萄糖醛酸化SN-38(SN-38G)，从而保护健康细胞免受伊立替康毒性的影响。UGT1A1基因呈多态性，最常见的是启动子区域的UGT1A1*28，野生型有6个AT重复，突变体为7个AT重复。含有较高数目的TA重复序列即TA7患者，与野生型TA6比较，UGTIAI基因的表达量降低且活性也降低。此外在UGT1A1基因1号、4号和5号外显子上核苷酸的改变也产生了一系列活性降低的突变体(UGT1A1*6、UGT1A1*7、UGT1A1*27、UGT1A1*29)。突变型UGT1A1*28的杂合子比野生型对SN-38的葡萄糖醛苷化活性稍低，而UGT1A1*28的突变纯合子对SN-38的葡萄糖醛苷化活性则仅是野生型的35％，从而更容易产生毒副作用。野生型UGT1A1(6/6)在接受伊立替康治疗时产生毒副作用风险较低，而UGT1A1*28突变型杂合子(6/7)产生毒副作用的几率为12.5％，突变型纯合子(7/7)则有50％产生毒副作用的可能性。该突变的影响是与剂量相关的，在使用低剂量伊立替康治疗时，UGT1A1突变与否对毒副作用的风险影响不大。学者针对118名服用依利替康的日本癌症患者进行了病例对照研究，在这118人中有26人发生了严重不良反应(发生频率为22％)，包括4级粒细胞减少，4级血样便腹泻或脱水，3级水样便腹泻。在出现严重不良反应的26人中，发生UGT1A1*28突变的有12人(46％，其中纯合子4人，杂合子8人)，另外没有发生不良反应中的92人中有13人是UGT1A1*28的突变的个体(14％)。研究者发现UGT1A1*28突变纯合子严重腹泻的发生率为70％，而*28突变杂合子和野生型纯合子中的发生率分别为33％和17％；另有研究证实4级粒细胞减少症的发生率在MM，WM和WW个体中的发生率分别为50％，12.5％和0。美国FDA明文规定UGT1A1*28突变的纯合子和杂合子的个体发生严重不良反应的风险极大的增加了(约7倍)，应当严加监控。在中国人中，野生型纯合子(6/6)、杂合子(6/7)和突变型纯合子(7/7)的发生频率分别为70.2％、27.7％和2.1％。UGT1A1*6(G71R，211G＞A)13％东方人特有。有研究显示UGT1A1*6突变使UGT1A1的葡萄糖醛酸化的能力下降70％，使伊立替康的毒副作用风险显著增加。

综上UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多态性是影响伊立替康需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多态性的试剂盒将为伊立替康的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

UGT1A1*6(rs4148323)和UGT1A1*28(rs3064744)基因多态性是影响伊立替康剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床伊立替康个体化用药治疗的用药基因UGT1A1*6(SEQ IDNO.1)和UGT1A1*28(SEQ IDNO.2)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测伊立替康个体化用药相关基因SNP。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序法检测伊立替康个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物：

(1)扩增引物：