[发明专利]一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法。

背景技术

α珠蛋白基因的拷贝数变异(Copy number variation, CNV)在人类基因组中很常见，有研究认为这种现象是人类进行化过程中与疟疾的自然选择相关。α珠蛋白基因缺失和多拷贝，均可导致所编码α珠蛋白表达降低可增高，而导致一系列的生物学性状：基因缺失导致α珠蛋白表达减少而导致α-地贫，基因多拷贝导致α珠蛋白表达增加而加重β-地贫症状。另外，α珠蛋白基因簇中，α1和α2这两个基因为高GC含量，且高度同源，其编码的多肽链完全相同，基因结构中，两者的X、Y、Z盒的DNA序列基本相同，仅在第二内含子及3’端非翻译区有些区别，而且还存在α2与α1基因在缺失情况下的形成融合基因的情况，这种情况在哺乳动物的基因组DNA序列中并不少见。

近年来，多种基于芯片的高通量方法用于识别全基因范围内的CNV，如芯片比较基因组杂交（Array comparative genomic hybridization, Array CGH）、SNP分型芯片（SNP genotyping arrays）以及深度测序方法（Deep sequencing-based approaches）。这些方法具有较高的分辨率，能区别出人类基因组中几kb至几Mb的序列差异，在全基因组范围内筛查和识别CNV，主要应用于CNV图谱的构建和疾病的关联分析，但并不适用于检测针对特异疾病的仅仅几个位点的拷贝数变化。

而针对靶位点CNV的检测方法有以下几种：多重连接探针扩增(MLPA), 多重可扩增探针杂交(MAPH), 短荧光片段多重定量PCR (QMPSF )以及实时荧光定量PCR( Real-time quantitative PCR )。这些方法都是以PCR为基础，适用于对特定靶位点进行定量分析。

MLPA是2002年Schouten首先报导的，可以检测出DNA序列的缺失和重复。该方法高效、特异，在一次反应中可以同时检测45个靶序列拷贝数的改变，已有针对不同遗传病进行诊断。Armour等人报导了一种基于多重可扩增探针杂交的MAPH方法，用于基因拷贝数变异的定量分析。该方法把特定的 PCR产物与固定在尼龙膜上基因组DNA杂交，通过 PCR和电泳技术检测杂交回收探针的量，以实现基因组中对应的 DNA 拷贝数的检测。MAPH与MLPA类似的地方在于，均可以实现40多种靶序列的同时检测，且结果准确、精度高，目前已经有包括乳腺癌等在内的多种遗传病用该方法进行分析的报道。短荧光片段多重定量PCR最早应用于染色体非整倍体的产前基因诊断。这项技术的原理是选取待检基因外显子上的一段短片段序列，用标记荧光的引物同时对多个短片段进行扩增，然后将扩增产物进行毛细管电泳分析，根据图谱中产物峰的长度和面积来计算待测位点的拷贝数。

现有检测特异位点拷贝数的方法普遍存在的缺点包括操作复杂，开放性检测平台容易造成样本间的交叉污染，仪器要求较高等等。以目前应用较广泛的MLPA方法为例，该方法的不足之处在于：1、开放式检测平台，容易造成污染；2、其设计的长探针不能通过普通的化学方法合成，需要通过M13载体克隆的方法获得；3、杂交步骤耗时过长（16小时）。这些都限制了其作为分子筛查方法的推广和应用。而MAPH方法要先固定样本DNA及洗脱未反应的探针，步骤繁琐，难以适应临床诊断的需要。

实时荧光定量PCR是目前临床诊断系统最受欢迎的检测平台。实时荧光定量PCR具备了传统PCR的优点，同时又克服了传统PCR的许多缺点。首先，操作简便，快速高效，具有很高的敏感性和特异性；其次，是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，有效的避免污染，而且直接检测结果，无需扩增后操作；另外，多荧光通道允许在同一反应体系中同时对多个靶序列进行扩增检测。但是多重PCR本身存在一些问题。不同引物对之间的错配扩增，不同靶序列扩增效率不一致导致效率低的靶点被扩增效率较高的靶点所抑制，这些都会影响拷贝数定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法。

本发明所采取的技术方案为：

一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，包括以下步骤： 

1)      设计一对通用引物，包括上游通用引物和下游通用引物；

2)      分别设计三种TaqMan探针，分别作为α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和内参基因的TaqMan探针；