[发明专利]鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法RT-PCR引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，涉及鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法RT-PCR引物及其应用。

 

背景技术

手足口病（hand foot and mouth disease，HFMD）是由肠道病毒引起的急性传染病，主要发生于3岁以下儿童，临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹。而引起手足口病的病原体有多种，如柯萨奇病毒A组的16、4、6、10、12，B组2、3、5，埃可病毒4、19、30，以及肠道病毒 71型（Enterovirus 71，EV71）等。其中以EV71和柯萨奇病毒A16（Coxsackievirus 16, CA16）最为常见。通常情况下，EV71和CA16等非EV71感染引起的手足口病在临床症状和体征方面难以区别，但EV71感染除了引起手足口病外，部分患者还能出现无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样的麻痹和神经源性肺水肿等多种神经系统并发症，病情凶险，可严重危害婴幼儿的生命健康，故倍受重视。近年来，我国及周边地区手足口病疫情日趋严重。2011年我国全年累计报告的病例161万余例，死亡509例。因此早期、快速、简便、准确地鉴别EV71型和非EV71型手足口病，对于积极的临床救治和疫情防控具有重要意义。

传统的病原学诊断采用细胞培养分离和鉴定病毒的手段，耗时且操作复杂，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。分子生物学的进展开拓了肠道病毒的快速诊断技术，特别是PCR技术，由于其检测材料用量少，快速，灵敏度高，特异性好，在病毒感染的诊断中发挥越来越多的重要作用。今RT-PCR技术已成为手足口病病原体快速诊断的重要手段，但目前建立的方法主要针对EV71和CA16，很容易造成其它病原体的漏诊；且每个检测都要单独进行，繁琐费时；若要检测其他EV，还要再增加一个PCR反应管，试剂消耗大，操作步骤多，容易造成实验失败。如能建立一种单管二重一步法RT-PCR，鉴别EV71型和非EV71型手足口病，将具有广泛的应用前景。

 

发明内容

解决的技术问题：本发明针对手足口病病原学检查方法的单一性，耗时耗力的不足，提供一种高效、便捷的鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法RT-PCR引物及其应用。

技术方案：

鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法RT-PCR引物，同时包括肠道病毒5’UTR通用引物和EV71 VP1基因特异性引物，所述肠道病毒5’UTR通用引物为：

引物F2：5’-TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’ ；

引物R1：5’-ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’ ；

所述EV71 VP1基因特异性引物为：

引物Fa： 5’-CCCAACACAGCYTAYATAATAGC-3’ ；

引物Rb：5’-GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC -3’；

其中R=A或G，W= A或T，Y=C或T。

上述引物是在相应引物上从3’末端、从5’末端或者同时从3’和5’末端有1-5个附加核苷酸加入或缺失的引物。

上述引物在制备鉴别EV71型和非EV71型手足口病核酸检测试剂中的应用。

从Genbank下载了世界各地的肠道病毒毒株，包含了肠道病毒所有67个血清型，用DNAMAN软件进行序列比对：

依据肠道病毒5’UTR设计通用引物：

引物F1：5’- AMCAAGCACTTCTGTTWCCCCGG -3’      23bp

引物F2： 5’- TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC -3’     24bp

引物R1：5’- ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC -3’     24bp

引物R2： 5’- CTYGATTGTCACCATAAGCAGCCA -3’     24bp；

 依据所有EV71病毒VP1基因设计特异性引物：

引物Fa： 5’- CCCAACACAGCYTAYATAATAGC -3’       23bp

引物Fb： 5’- CAGGGAGATAGRGTGGCRGATG -3’       22bp

引物Fc： 5’- TGGRGCATCRTCRAATRCTAGTG -3’       23bp