[发明专利]一株产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

3-羟基丁酮又名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，天然存在于乳品和某些水果中，是一种应用广泛的食用香料，它具有令人愉快的奶油香味，我国GB2760-86规定其允许食用，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。3-羟基丁酮作为香料应用范围极其广泛，用量也很大。此外，3-羟基丁酮还可以作为一种平台化合物，广泛应用于日化食品、制药、涂料、液晶材料等众多领域。2004年，美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一，近年来，随着人们对3-羟基丁酮需求的不断增长，有关3-羟基丁酮的生产方法及应用研究已引起人们的广泛关注。

目前3-羟基丁酮的合成方法主要两种：一是化学合成法，二是生物合成法。化学合成法存在着产品收率低，环境污染较严重等缺点，而且其产品质量很难达到目前3-羟基丁酮的最大消费领域——食用香料的要求，更为严重的是化学合成法的原料大都是利用不可再生的化石资源——石油，原料来源也受到限制。生物合成法又包括酶法和微生物发酵法，酶法是以丁二酮或丁二醇为原料在特异性酶的作用下生成3-羟基丁酮，该方法转化率能达到100％，且产物具有旋光度，但是和化学法一样原料来源受到限制，并且获得大量特异酶很困难。目前用于3-羟基丁酮生产及研究的菌株主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属(Lactococcus)等，也有研究者发现在某些酵母中也能少量积累3-羟基丁酮。但是在大多数菌株代谢过程中，3-羟基丁酮的积累量均很低，大都作为2，3-丁二醇的代谢副产物而产生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株产3-羟基丁酮的基因工程菌，它是将Nox基因通过表达载体pDK7转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011得到的基因工程菌。

上述基因工程菌的构建方法，利用PCR技术从质粒载体pTEF-Sup35C中扩增出Nox基因，将Nox基因连在表达载体pDK7多克隆位点处，得到重组质粒pDK7-Nox，再将重组质粒pDK7-Nox转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011，得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产3-羟基丁酮的基因工程菌Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7-Nox。

本发明所述的表达载体pDK7来源于Mike J.Merrick教授(AFRC-IPSR Nitrogen Fixation Laboratory，University of Sussex，Brighton BNI 9RQ，UK)，其构建方法参考文献Construction of Multicopy Expression Vectors for Regulated Overproduction of Proteins in Klebsiella pneumoniae and Other Enteric Bacteria[J].DIETMELM KLEINER，WYATT PAUL AND MIKE J.MERRICK.Journal of General Microbiology，1988，134，1779-1784.

上述构建方法，具体包括以下步骤：

(1)基因Nox的克隆：

根据Genebank公布的肺炎链球菌(S.pneumoniae)中Nox基因(Gen Bank：AF014458.2)，序列设计合引物：

P1：5’-CGGGGTACC(Kpn I)TAAGGAGGATATACATATGA AAGTCACAGTT-3’；

P2：5’-CGGCTGCAG(Pst I)TTAAGCGTTAACTGATT-3’；

引物两端分别引入限制性酶切位点Kpn I和Pst I，以pTEF-Sup35C为模板完成PCR反应；