[发明专利]一株产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一株产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，它是将Nox基因通过表达载体pDK7转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011得到的基因工程菌。

2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，利用PCR技术从质粒载体pTEF-Sup35C中扩增出Nox基因，将Nox基因连在表达载体pDK7多克隆位点处，得到重组质粒pDK7-Nox，再将重组质粒pDK7-Nox转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011，得到重组的肺炎克雷伯氏菌，即产3-羟基丁酮的基因工程菌Klebsiella pneumoniae CICC 10011-pDK7-Nox。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)基因Nox的克隆：

根据Genebank公布的肺炎链球菌(S.pneumoniae)中Nox基因序列设计合引物：

P1：5’-CGGGGTACCTAAGGAGGATATACATATGAAAGTCACAGTT-3’；

P2：5’-CGGCTGCAGTTAAGCGTTAACTGATT-3’；

引物两端分别引入限制性酶切位点Kpn I和Pst I，以pTEF-Sup35C为模板完成PCR反应；

PCR的8管反应体系是：Buffer 22.5uL，ddH₂O 141.3uL，MgCl₂13.5uL，dNTP-mix18uL，引物P14.5uL，引物P24.5uL，Taq酶2.7uL；混合均匀后，分成8管，再向每管加入2uL模板DNA；PCR反应条件：94℃预变性3.5min；进行30个循环反应：94℃变性45s，52.6℃退火45s，72℃延伸90s；最后72℃保温10min，反应结束后4℃保存，反应终止后，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，与pUC18载体连接，进行序列测定，Kpn I和Pst I酶切重组pUC18载体，回收1.35Kb片段，KpnI和Pst I酶切pDK7载体，回收大片段产物，将双酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接获得重组质粒pDK7-Nox；

(2)重组基因工程菌的获得：

将重组质粒pDK7-Nox转化肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011，涂布含40μg/mL的氯霉素平板，挑取阳性转化子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组肺炎克雷伯氏菌，命名为Klebsiella pneumoniae CICC 10011-pDK7-Nox。

4.权利要求1所述的基因工程菌在生产3-羟基丁酮中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用基因工程菌，以葡萄糖为底物发酵生产3-羟基丁酮的工艺如下：

(1)出发菌株：Klebsiella pneumoniae CICC10011-pDK7-Nox；

(2)种子培养：

种子培养基：葡萄糖50～80g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母膏3～7g/L，NaCl 5～10g/L，氯霉素20～40μg/mL，溶剂为水；

培养条件：250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度31～37℃，摇床转速120～180r/min，培养12～24h；

(3)发酵培养：

培养基组成：葡萄糖80～200g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母膏3～7g/L，NaCl 5～10g/L，氯霉素20～40μg/mL，溶剂为水；

培养条件：接种量10％(v/v)，发酵温度31～37℃，当OD达到0.6～0.8时加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的终浓度1.0mmol/L，摇床转速180～250r/min，发酵72～96h。