[发明专利]HLA-A0201限制性抗原特异性CTL制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术开发与应用研究领域，涉及一种HLA-A0201限制性抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)制备方法。

背景技术

一、肿瘤治疗的困境与机会

恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展

上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注(3×10^10-11)，另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2(IL-2)(10万IU/kg，q8h)，因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素γ(IFN-γ)、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体(Mouse anti-Human CD3mAb)共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。

树突状细胞(DCs)是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APC)，其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子(MHC I类和MHC II类分子)，免疫共刺激分子(CD80、CD83、CD86、CD40等)。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8(IL-8)、干扰素α(IFN-α)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，增强机体非特异性免疫应答(天然免疫)，故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。

三、CTL作用机理

1、机体T细胞免疫反应过程

机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体(TCR)特异识别不同的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肽)，被活化为具有杀灭靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。

CTL免疫应答大致分四个阶段：

(1)抗原识别：APC通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤细胞)；

(2)抗原加工与递呈：抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的MHC-I类或II类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；

(3)T细胞激活(双信号学说)：APC与T细胞相遇，T细胞通过自身TCR识别APC递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中CD8+T细胞识别MHC-I-多肽复合物，CD4+T细胞识别MHC-II-多肽复合物，T细胞接受了抗原的刺激信号(第一信号)加上免疫共刺激信号(第二信号)开始活化，具有细胞毒性作用即CTL；

(4)靶细胞杀灭：活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤和清除。