[发明专利]HLA-A0201限制性抗原特异性CTL制备方法

权利要求书

1.HLA-A0201限制性抗原特异性CTL制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

a.CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化：

单采收集外周单个核细胞作为CTL前体细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从收集外周单个核细胞中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞；

b.目标CTL诱导与第一轮扩增：

用负载HLA-A0201限制性目标抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，同时加入rhIL-2和rhIL-7两种细胞因子联合促进T细胞生长；第二周再重复刺激一次，完成第一轮扩增；

c.目标CTL纯化方法：

采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL，即选择Tetramer+CD8+T淋巴细胞；

d.目标CTL第二轮扩增：

采用固相包被的anti-human-CD3mAb和IL-2刺激目标CTL的生长；加入经γ射线辐照后的自体外周单个核细胞增强对目标CTL的活化；加入rhIL-15继续培育，完成第二轮扩增，收集鉴定。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中目标抗原为已知的具有明确抗原表位和HLA-A0201限制性的肿瘤或病毒抗原多肽，多肽长度为9-15个氨基酸。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于目标抗原为Her2-neu抗原多肽、AFP抗原多肽、CEA抗原多肽、PSA抗原多肽、HBV抗原多肽、EBV抗原多肽或HPV抗原多肽。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中负载目标抗原的自体成熟DC是通过下列方法制备得到的：将外周单个核细胞贴壁后加入含rhGM-CSF、rhIFNα、灭活的混合正常人AB血清和RPMI1640培养基培养三天，收获DC再加入目标抗原孵育即得。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c中用于目标CTL扩增的γ射线辐照的自体外周单个核细胞是通过下列方法制备得到的：留取部分权利1中单采获得外周单个核细胞，经30-50GY的γ射线辐照后保存；保存液：含20％(V/V)DMSO和20％(V/V)正常人AB血清的RPMI1640培养液，保存温度：-80℃超低温保存。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤d中用于目标CTL扩增的CD3单抗克隆抗体(CD3-mAb)是如下操作的：将CD3单抗固相包被于用于扩增细胞的容器表面，CD3-mAb可与多个CTL表面的CD3分子结合，促进CTL细胞克隆的形成，促进细胞接触，快速进入增殖周期。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于目标CTL是指表达识别特定抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴细胞。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于各步骤中刺激分子或细胞的初始加入量分别为：

a.目标CTL第一轮扩增：rhIL-2终浓度为500-1000IU/ml，rhIL-7终浓度为50-100ng/ml，DC与起始CD8+T细胞数量比为1∶5。

b.目标CTL第二轮扩增：rhIL-2终浓度为250-500IU/ml，rhIL-15终浓度为100-250ng/ml，CD3单克隆抗体包被浓度为1.0-3.0μg/ml，γ射线辐照的外周单个核细胞与起始CTL数量比为2∶1。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于各步骤操作后细胞数量与表型特征分别为：