[发明专利]一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物筛选和培养领域，尤其涉及一种活的非可培养（VBNC）菌种的复苏培养基及其制备方法和应用。

背景技术

VBNC（viable but non-culture）指的是有些微生物可以在它们的栖息地被检测到存在，但不能在实验室进行人工培养。1982年徐怀恕等通过对 V.cholerae和E.coli 存活规律的研究，首次发现并提出了细菌活的非可培养状态（Viable but non-culturable state，VBNC），即细菌处于不良环境条件下，其细胞通常缩成球形（最近许多研究中发现还有些细菌表现为体积增大，细胞伸长），用常规方法培养不能使其生长繁殖，但仍然具有代谢活性，在DNA合成抑制剂的作用下，添加一定量的营养物培养时，这些细胞虽然不能分裂，但仍可以伸长生长，证明其仍然存活，并非死亡.处于VBNC状态的细菌，在一定的条件下可以复苏。

现在在自然生态环境中的细菌能够经传统分离法获取的仅有0.01-10%，绝大部分处于活的非可培养（VBNC）、类似于休眠的状态。就环境微生物资源而言，如何获取自然界中90-99.99%的资源菌种需要有新思路、新方法的创新，才能挖掘、开发、利用这些未知的微生物资源。

中国发明专利申请（申请号：200810051555.3 申请日：2008-12-09）公开了一种VBNC沙门氏菌的复苏液及其制备方法和复苏方法，复苏液是由血清1份、灭菌纯水1～3份组成，经混合搅拌混匀，用微孔滤器过滤除菌制得；将进入VBNC的沙门氏菌置于复苏液中，在热程控循环仪孔内，采取递增升温方式，热程控循环仪复苏升温与温育时间程序选自在5℃到37℃区间，温育时间为2MIN～1.5H；然后接种于SS液体培养基，并在气浴振荡摇床内，200～220R/MIN培养。

（丁林贤, 苏晓梅, 横田明. 活的但非可培养(VBNC)状态菌的研究进展及应用展望.《微生物学报》.2011, 51（7）: 858-862.） 阐述了VBNC 状态菌的形成机理、转变与种类、复苏、研究意义及其应用展望。并报道了丁林贤等在十余年间针对生态环境中处于VBNC 状态菌的复苏、可培养化、系统进化关系及潜在功能等方面的一些研究成果，拟为微生物资源的开发与应用提供新的科学依据。并公开了复活促进因子( Rpf，resuscitation promotingfactor) 是由藤黄球菌(M. luteus) 分泌的一种能使处于VBNC 状态的该菌重新恢复其生长繁殖能力的蛋白质，分子量约为16 － 17 kDa。Mukamolova报道了Rpf 可以复苏处于VBNC 时期的革兰氏阳性菌Mycobacterium 属的结核分枝杆菌(M． tuberculosis)、

牛分枝杆菌(M． bovis )、堪萨斯分枝杆菌(M．kansasii) ，耻垢分枝杆菌(M． smegmatis) 和鸟分枝杆菌(M． avium) 等。并且同Rpf 相似的基因也在链霉菌、结核菌、棒状杆菌等高GC 的革兰氏阳性菌中被发现。另外，Mukamolova等人还报道了Rpf 采用自分泌或旁分泌的方式分泌信号，不但能使休眠的微生物复活，还可以刺激正常菌的生长，并能调控细胞的繁殖过程。但是在该文献中没有公开采用何种配方的复苏培养基，而且在实际应用中，单纯的复活促进因子在促进非可培养(VBNC)状态菌复苏生长以及分离丰度上效果还未非常显著。

发明内容

为了解决活的非可培养（VBNC）菌种的复苏生长以及分离丰度的技术问题。本发明的第一个目的是提供一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，该培养基利用一种特殊蛋白质信号分子构建能够促进VBNC细菌复苏生长，提高从生态环境中分离VBNC细菌丰度。第二个目的是提供上述的复苏培养基的制备方法。第三个目的是提供上述的复苏培养基的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种能促进VBNC细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基，该复苏培养基由培养基基液、细菌液和土壤液构成；所述的细菌液由藤黄微球菌菌种在菌种液体培养基上培养至对数期后期，经离心去除菌种液体培养基提取获得蛋白质，含有复活促进因子Rpf，细菌液按体积比为培养基基液的0.5-30%；所述的土壤液由经风干、过筛、去除杂质的土壤，加水，多次灭菌，过滤取滤液或离心取上清液，土壤液按体积比为培养基基液的0.1-20%。

作为优选，上述的细菌液按体积比为培养基基液的1-10%，土壤液按体积比为培养基基液的1-5%。