[发明专利]一种无背景定向克隆PCR产物的载体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种可无背景定向克隆PCR产物的载体，还涉及一种可无背景定向克隆PCR产物载体的制备方法，同时还涉及一种可无背景定向克隆PCR产物载体的应用。

背景技术

PCR(polymerase chain reaction)是分子生物学中的常规的实验技术，大部分基因功能探讨等都需要将目的片段通过PCR扩增出来然后克隆到相应的载体来进行研究。目前克隆PCR产物的方法有很多种，包括传统的酶切连接技术，新开发的不依赖酶切的Gateway系统，不依赖于T4 DNA连接酶的Topo cloning以及不依赖于连接酶的克隆系统(ligation-independent cloning，LIC)等。尽管如此，在一些如cDNA文库构建，蛋白相互作用网络检测，转录调控网络研究等需要大规模构建克隆的工作中，前面提到的这些方法都具有各自的局限性。酶切连接的方法操作繁琐，且受限制性内切酶识别位点的限制，Gateway和Topo cloning操作成本较高，LIC的方法依赖于10-15bp的单链DNA互补区，该区域通常容易形成二级结构从而影响克隆的效率。因此，最简单的方法还是将PCR产物直接与相应的载体进行连接。

PCR产物直接连接载体常规方法就是采用TA克隆方案，利用Taq酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性在PCR产物的3’端加上单个脱氧核苷酸A，然后在克隆载体上通过一定方法的处理(包括加dT尾和采用特异性内切酶等)获得突出dT，通过TA互补在T4DNA连接酶的作用下完成直接连接。利用此原理，现在已经开发了多种商业化的T载体，通过各种改造，目前研究者已经开发出不同筛选标记的T载体，以及高阳性率的T载体等，但由于目的片段两端都带有同样的dA尾，目的片段插入正反的筛选依然是目前存在的一个问题。虽然目前有通过给PCR产物引入特异性碱基，使之正向和反向插入到载体后与载体序列组合成不同限制性内切酶识别序列，通过将连接产物进行特异性内切酶处理可以较大程度上去除片段的插入正反，但增加了实验步骤，操作繁琐，特别是在大规模克隆过程中增加其工作量。

另外一种PCR产物直接克隆的方法是平末端连接。由于Taq酶不具有3’-5’外切酶活性，PCR过程中具有相对较高的错配率，在调取基因时一般都采用具有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶来扩增，由此得到的PCR产物不具有突出的A尾，只形成平末端产物。平末端产物的连接载体也必须是平末端，其载体自连是平末端连接过程中的一大困扰。载体去磷酸化等处理可以降低载体自连的概率，但由此PCR引物需要经过磷酸化处理，很大程度上增加了实验成本，由于载体去磷酸化效率的问题，克隆阳性率远不能达到100％，PCR产物平末端克隆插入正反的筛选也给大规模克隆增加了工作量。

综上所述，虽然PCR产物的直接克隆在大规模克隆构建上具有操作简单等优势，但在克隆筛选上还需要很大程度上进行优化。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体，该载体可以达到无背景、定向克隆PCR产物的目的。

本发明的另一个目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体的制备方法，方法易行，成本低廉，为基因克隆特别是大规模克隆提供方法。

本发明的再一个目的是在于提供了一种PCR产物克隆载体的应用，该载体既可以完成PCR产物的TA连接克隆，又可以完成平末端连接克隆，且在两种克隆方法中的应用均可以达到无背景、定向克隆的效果。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明设计的克隆载体将PCR片段插入位点设计为抗性基因不具有活性的核糖体结合位点内部，克隆构建过程中通过PCR片段一段引入能与载体序列组合成有活性核糖体结合位点的方式来筛选正确的克隆，而载体自连和片段反向插入均造成筛选标记基因的核糖体结合位点不具有活性，从而达到无背景、定向克隆的目的。