[发明专利]一种无背景定向克隆PCR产物的载体及制备方法和应用

权利要求书

1.一种无背景定向克隆PCR产物的载体，其特征在于：所述的载体为pDNB1。

2.根据权利要求1所述的一种无背景定向克隆PCR产物的载体，其特征在于：所述载体的筛选标记基因读码框前含有人工合成的XcmI盒，XcmI盒的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述的重组载体pDNB1的制备方法，其步骤是：

A．制备中间载体pBP1：

a．利用特异性引物以pUC18载体为模板用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo扩增包括Amp抗性基因、复制子，lac启动子元件的载体框架；扩增体系为：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μl，2 mM dNTPs 5μl，25 mM MgSO₄ 3μl，10 μM 正向引物 1μl，10 μM 反向引物 1μl，pUC18 DNA 100ng，超纯水加到最后体系为50μl，最后加KOD-Plus-Neo 1U；正向引物：SEQ ID No:2，反向引物：SEQ ID No: 3；利用PCR回收试剂盒纯化后得到载体框架片段，然后用识别片段两端限制性位点的内切酶BglII和KpnI对载体框架片段进行酶切，并回收相应片段；

b．利用特异性引物以pACYC184质粒为模板用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo扩增cat基因的读码框；扩增体系为：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μl，2 mM dNTPs 5μl，25 mM MgSO₄ 3μl，10 μM 正向引物 1μl，10 μM 反向引物 1μl，pACYC184 DNA 100ng，超纯水加到最后体系为50μl，最后加KOD-Plus-Neo 1U，正向引物：SEQ ID No: 4，反向引物：SEQ ID No: 5；利用PCR回收试剂盒纯化，利用识别cat基因的读码框两端的内切酶BglII和KpnI对片段进行酶切，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的片段；

c．将步骤a和步骤b获得的回收后的片段以摩尔比1：3混合，在T4 DNA连接酶作用下形成闭合环状，后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，用Amp筛选获得阳性克隆，从中提取质粒并测序鉴定，得到中间载体pBP1；

B．构建目的载体pDNB1：

a．设计、合成XcmI盒核苷酸序列；

b．将XcmI盒用PstI和SphI进行酶切，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的片段；

c．将中间载体pBP1用PstI和SphI酶切，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的片段；

d．将酶切回收的XcmI盒和酶切回收后的中间载体pBP1以摩尔比3：1混合，在T4 DNA连接酶作用下形成闭合环状，后转入大肠杆菌DB3.1感受态细胞，用Amp筛选获得阳性克隆，从中提取质粒并测序鉴定，得到载体。

4.权利要求1所述的载体在PCR产物TA克隆中的应用。

5.权利要求1所述的载体在PCR产物平末端连接克隆中的应用。