[发明专利]利用烟草瞬时表达系统高效表达禽流感Re-5疫苗株血凝素（HA）基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质表达领域。具体的说，本发明涉及利用烟草瞬时表达系统表达禽流感病毒血凝素(HA)基因。 

背景技术

世界范围内对重组蛋白的要求在以很快的速度增长，这种增长速度通过传统的生产蛋白的方法是无法满足的。重组蛋白主要是药用蛋白，包括抗体、疫苗以及工业上使用的酶和次级代谢产物。传统生产重组蛋白的系统包括细菌和哺乳动物系统，但是这些系统因本身的复杂性和生产成本较高受到限制，因为传统系统需要复杂的发酵设备和昂贵的下游纯化过程。在植物中表达重组蛋白，一方面可以满足不断增长的蛋白需求；另一方面，植物表达系统有很多其它表达系统没有的优点。植物作为“绿色生物反应器”具有很多独特的优点。首先，植物表达系统具有真核生物蛋白表达后的修饰系统，包括糖基化、二硫键的形成，这些对于维持蛋白的生物活性非常重要。其次，“绿色生物反应器”不存在交叉感染的危险，因为到目前为止没有发现跨界的病原体。和传统的细胞培养系统相比，植物生长所需要的条件简单，并且非常经济，它只要光作为主要能量，这进一步降低了成本。对于药用蛋白来说，后期纯化也比较简单。烟草作为植物界的“白鼠”，被用作为绿色反应器的主要平台。主要原因包括：首先，烟草是多叶植物，具有很高的生物量。其次，烟草具有多种转化方式，包括农杆菌介导的瞬时表达、病毒侵染、稳定遗传以及叶绿体工程。再次，烟草即不是食物也不是饲料，不会污染食物链和饲料链。这些特点使烟草非常适合应用于表达外源蛋白。 

禽流感(Avain Influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的鸟类病毒性传染病，高致病力毒株(Highly Pathogenic Avain Influenza Virus，HPAIV)的流行可导致感染鸡群的死亡率达100％。 

血凝素是指红血球凝聚素。病毒的表面存在两种蛋白质，一种称为红血球凝聚素(Hemagglutinin)，另一种为神经氨酸酶(Neuraminidase)。高致病性禽流感病毒H5N1中的“H”指代前者，“N”指代后者。而就目前而言，红血球凝聚素有16种形态，神经氨酸酶则有9种形态。它们会引发免疫系统作出反应，特别是红血球凝聚素，当身体需要产生预防流感抗体时，身体会主动找寻这种蛋白质。血凝素(HA)是(Avian Influenza Virus，AIV)的主要保护性抗原，以HA研制的亚单位疫苗可对同一H亚型不同毒株产生良好的免疫保护性。 

Re-5疫苗株用于预防H5亚型禽流感病毒引起的鸡、鸭、鹅的禽流感。遗传信息在由mRNA到蛋白质的传递过程中是以三联体密码子的形式传递的。每种氨基酸至少对应一个密码子，最多的有六种对应密码子。编码同一种氨基酸的密码子成为同义密码子。在蛋白质的合成过程中，同义密码子的使用频率并不相同。某一种物种或某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义密码子，这些密码子被称为最优密码子，此现象被称为密码子偏好性。本实验室根据目前使用的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因序列，在GenBank中经比对后选定目前所用核酸序列。根据烟草密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的情况下，对选定的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因序列进行优化。委托上海生工生物有限公司合成并构建到PUC57载体上。本实验从PUC57载体中扩增得到Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，利用烟草瞬时表达系统确定该基因的亚细胞定位，将该基因构建到两个植物表达载体上，并从RNA水平和蛋白水平证明该基因在烟草中得到了瞬时表达。 

发明内容

本发明从含有人工合成的目的基因的载体PUC57中扩增出Re-5疫苗株血凝素(HA)基因。血凝素(HA)是禽流感病毒的主要保护性抗原，对生产抗原性疫苗具有重要意义。 

本发明所述的禽流感Re-5疫苗株血凝素基因，经过密码子优化，它的序列如SEQ ID No.1所示。 

一种含Re-5疫苗株血凝素HA基因的表达载体， 

本发明还构建了植物双元载体HA-pK7FWG2.0，用于确定所述的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的亚细胞定位，实验结果显示该基因定位在细胞间隙，这对于后来蛋白提取方法的确定非常重要。pK7FWG2.0植物双元载体是Gateway系统的载体，载体构建过程不需要考虑酶切位点，方便快捷。