[发明专利]竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

长期以来，一直被认为是“不治之症”的肿瘤是医药界研究热门课题之一。现有的抗肿瘤药物疗效很有限，而且大多有严重的副作用，使用效果远远没有达到人们的预期。目前市场上还有一类免疫治疗药物，即经过激活人的免疫功能以达到促进攻击癌细胞的药物也不少，但因各种癌细胞本身具有免疫力，所以疗效并不理想。因此，目前抗肿瘤药物的开发也成为本世纪新药研究的重大课题。蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一种有潜力的抗肿瘤制剂，具有广阔的临床应用前景，但目前采用提取蛇毒L-氨基酸氧化酶的工业化生产还不现实。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，为研制新型的抗肿瘤药物打下基础并使得大规模制备蛇毒L-氨基酸氧化酶成为可能。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法。该方法按照下列步骤进行：

(1)竹叶青蛇毒毒腺总RNA的提取和RT

从-70℃冰箱取出竹叶青蛇的毒腺，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取竹叶青总RNA；以抽提的总RNA为模板反转录为cDNA，反应按照Promega公司逆转录试剂盒手册进行，其反应体系为：42℃60min，95℃10min，4℃保存；

(2)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的PCR扩增

以cDNA为模板，根据Genebank中公布的竹叶青L-氨基酸氧化酶的基因序列的开放阅读框利用Primer Primer 5.0软件设计引物进行PCR扩增；所述引物中，上游引物为：含BamHI酶切位点5’-CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA-3′；含HindIII酶切位点5’CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT-3′；

(3)PCR扩增产物的回收

将PCR扩增产物于0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳分离30min后，在紫外灯下观察并切下含有目的条带的凝胶，按照胶回收试剂盒说明回收DNA片段，回收产物保存于-20℃；

(4)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的克隆与测序

将扩增竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶目的片段与pMD18-T载体连接，然后转化感受态细胞，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并将其铺于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板中进行培养，在37℃培养12～16h后观察结果；挑取菌落进行接种在含50μg/mL氨苄青霉素(AMP)的LB培养液中，取2μL为模板进行PCR鉴定，阳性的克隆菌株进行测序；

(5)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶序列分析

通过BLAST搜索与其同源性高的基因序列，通过ORF Finder软件预测竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因开放阅读框，并用BLAST验证；用信号肽预测软件Signal IP进行信号肽预测，并通过BLAST搜索与竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因阅读框编码的氨基酸序列同源性高的其他同系物，并作比较。

上述的竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法，步骤(2)中，PCR反应体系为：2×TaqPCR MasterMix：25μL；cDNA产物：3μL；无菌水：19μL，上下游引物各1.5μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，循环扩增30次，最后72℃延伸10min。

竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用。

为验证竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的治疗效果，发明人进行了一系列的实验，其结果如下：

1.试剂与材料

1.1试剂：IPTG，Sigma公司产品；Taq酶，捷瑞生物公司产品；BamH I和Hind III，MBI公司产品；SDS，TaKaRa公司产品；DNA Marker DL2000，TaqPCR MasterMix，BL21(DE3)，大连宝生物公司产品；DNA回收试剂盒，QIAGEN公司产品产品；PCR引物，由上海生工合成；pMD18-T-ALAg，由贵阳中医学院微生物实验室制备；Pet28a(+)，Invitrogen产品。

1.2材料：竹叶青蛇毒，采自贵州省思南县；白兔，购自贵阳医学院实验动物中心；癌细胞株，购于中科院细胞所。

2方法