[发明专利]一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

生物学活性评价是生物制品质量最客观、有效的指标，因此建立生物制品的生物学活性检测方法也成为质量研究的重点之一。目前，已报道的生物学活性测定方法主要是利用商业化的细胞株，其特点是细胞株的专一性不好，用于生物性活性测定时常常遇到样品对细胞株的依赖性较差或样品对细胞株的依赖性缺乏梯度等问题，给样品的生物学活性测定过程带来很多限制因素。而生物学活性是评价生物制品质量最重要的指标，因此，在质量研究过程中迫切需要一种能够稳定、专一的测定生物制品生物学活性的方法。

角化细胞生长因子(Keratinocye Growth Factor，简称KGF)属于成纤维细胞生长因子家族，特异性地与上皮细胞受体结合，刺激上皮细胞的增殖、分化以及迁移，在上皮细胞的增殖与损伤修复中发挥独特的功能。目前报道的KGF生物学活性的测定主要通过Balb/MK细胞的胸苷摄入试验其生物活性，其缺点是，细胞对KGF的刺激不敏感，容易影响对产品质量的判断，因此需要探索新的生物学活性测定方法。

血小板生成素(Thrombopoietin，简称TPO)及血小板生成素模拟肽(TPO-mimetide，简称TMP)作为一个造血细胞生长因子(hematopoietic growth factor，简称HGF)，与KGF和红细胞生成素(Erythropoietin，简称EPO)一样均属于生长因子(Growth Heromne，GH)亚家族成员，其生理功能的发挥主要是通过与靶细胞表面的血小板生成素受体C-Mpl结合实现的。C-mpl多肽序列全长有633个氨基酸，成熟的C-MPL由胞外区、穿膜区和胞内区组成。胞外区有两个受体结构域，远膜结构域在传递TPO的刺激信号中起重要作用，近膜结构域含有保守的WSXWS序列；穿膜区由22个氨基酸组成且多为疏水性氨基酸；胞内区由122个氨基酸组成，其中脯氨酸和丝氨酸含量分别占12％和11.5％，无典型的蛋白激酶结构，近膜处的Boxl和Box2在信号的传导中起重要作用，它们的丢失均可失去激活JAKs(Just anotherkinase或Janus kinase的简称)途径的功能，而切除C末端20个氨基酸则将失去Shc的磷酸化功能，后者为Ras途径的起始。

TPO及其类似物的生物学活性测定主要利用Mo7e(人巨细胞白血病细胞株)，该细胞是M-07细胞系的亚系，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，简称GM-CSF)、人干扰素α抗体(IFN-α)、人干扰素(IFN-ss)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(Interleukin-2，简称IL-2)、白介素3(Interleukin-3，简称IL-3)，白介素4(Interleukin-4，简称IL-4)、白介素6(Interleukin-6，简称IL-6)、白介素15(Interleukin-15，简称IL-15)、神经生长因子(Nervegrowthfactor，简称NGF)、TPO可促进细胞增殖。该细胞也可不依赖细胞因子生长，但生长缓慢，可用于测定多种细胞因子的活性，因此，在生物学活性测定过程中对细胞因子的依赖性较差，并且，实验室通过实验证明该细胞株在测定TPO及其类似物生物学活性时，细胞株对TPO及其类似物的不太敏感。同时也有UT-7、TD-3等细胞是通过对细胞进行药物适应性驯化筛选获得细胞株，但是经过驯化的细胞株在长期的测定过程中性状容易改变，影响实验结果。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法，解决了生物制品质量分析过程中建立生物学活性测定方法的难题。

一种用于生物学活性测定的质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述用于生物学活性测定的质粒的制备方法，步骤如下：

(1)用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切的表达调控元件(EASE)，构建质粒pCIneo-ease；

(2)用限制性内切酶MluI和XbaI双酶切步骤(1)制得的质粒pCIneo-ease，插入经限制性内切酶MluI和XbaI双酶切的核糖体结合位点序列(IRES)，构建质粒pCIneo-ease-IRES；