[发明专利]一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法

权利要求书

1.一种用于生物学活性测定的质粒，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述用于生物学活性测定的质粒的制备方法，步骤如下：

(1)用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切的表达调控元件，构建质粒pCIneo-ease；

(2)用限制性内切酶MluI和XbaI双酶切步骤(1)制得的质粒pCIneo-ease，插入经限制性内切酶MluI和XbaI双酶切的核糖体结合位点序列，构建质粒pCIneo-ease-IRES；

(3)用限制性内切酶XbaI和NotI双酶切步骤(2)制得的质粒pCIneo-ease-IRES，插入经限制性内切酶XbaI和NotI双酶切的潮霉素基因片段，构建真核表达载体pCIneo-ease-IRES-Hygromycin，即得用于生物学活性测定的质粒。

3.一种生物学活性测定细胞，该细胞含有权利要求1所述用于生物学活性测定的质粒。

4.权利要求3所述生物学活性测定细胞的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)用限制性内切酶XhoI和MluI双酶切用于生物学活性测定的质粒，插入经限制性内切酶XhoI和MluI双酶切的细胞因子受体表达基因构建真核表达载体pCIneo-ease-receptor-IRES-Hygromycin；

(2)将步骤(1)制得的真核表达载体pCIneo-ease-receptor-IRES-Hygromycin以电击转化的方式导入到宿主细胞，得转化细胞；

(3)将步骤(2)制得的转化细胞以氨基糖苷类抗生素G418和潮霉素B进行筛选，获得细胞群体，再加入细胞因子进行筛选，获得表达受体M的细胞群体；

(4)将步骤(3)制得的细胞群体进行单克隆筛选，获得单克隆细胞株，即得。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中细胞因子受体表达基因是指细胞因子KGF、TPO、EPO或IL11的受体表达基因。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的电击转化，步骤如下：

收集处于对数生长期的宿主细胞；将生物学活性测定质粒加入到细胞悬液中，混合均匀，得细胞混合液；将细胞混合液加到电转杯中；在脉冲强度为100V-600V条件下电击7-20ms，即得。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的生物学活性测定质粒的浓度为每百微升5-16μg；优选的，所述步骤(2)中的宿主细胞为32D细胞株；优选的，所述步骤(2)中的宿主细胞是经过预处理的宿主细胞，预处理过程如下：

将宿主细胞由液氮中取出，置于37℃水浴锅中，使冻存的细胞在1分钟内解冻，然后离心，弃上清，用完全培养基重悬细胞，在体积百分比为5％CO₂的培养箱内静置培养，每三天进行传代、扩培。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，上述完全培养基，是向RPMI1640培养液中添加培养基总体积10％的灭活胎牛血清，再加入mIL-3，使mIL-3的终浓度达到10μg/ml。

9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在加入细胞因子筛选前，还包括去除mIL-3的步骤；优选的，所述步骤(3)中的细胞因子选自KGF、TPO、EPO或IL11。

10.权利要求1所述用于生物学活性测定的质粒、权利要求3所述生物学活性测定细胞在检测生物制品中细胞因子KGF、TPO、EPO或IL11活性中的应用。