[发明专利]导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种人畜共患病的重要致病菌，并且是毒力最强的致病菌。其可引起局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒血症等全身感染。同时，金黄色葡萄球菌也是国内外最常见的细菌性食物中毒病原之一。据美国疾病预防控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希氏菌，居第二位，占细菌性食物中毒的33％。在我国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒事件的25％，而在美国、加拿大等发达国家，更是高达50％。美国每年因被金黄色葡萄球菌感染而丧生的人数已超过死于艾滋病人数。因此，金黄色葡萄球菌的防治具有重要的公共卫生学意义及经济意义。

近年来，随着对金黄色葡萄球菌致病机理研究的不断深入，人们认识到，细菌感染的第一步就是在体内定殖，而实现定殖的前提是细菌黏附在宿主的组织表面。这也就要求细菌有可以黏附到组织表面的组分，即黏附素。从20世纪开始，国外的研究学者对金黄色葡萄球菌的黏附素进行了广泛的研究，发现了金黄色葡萄球菌主要黏附素——纤黏蛋白原凝集素A(ClfA)，ClfA主要黏附于纤维蛋白原和纤维蛋白上，与乳腺、皮下、血管、心内膜等的感染有关。迄今为止，所有临床分离的金黄色葡萄球菌中都存在编码ClfA的基因clfA。

对金黄色葡萄球菌黏附素表达调控的研究发现，在金黄色葡萄球菌感染的早期主要表达黏附素，之后才表达毒素和荚膜，所以，对金黄色葡萄球菌的黏附进行干预，可以减少或阻止毒素和荚膜的表达，而以黏附素作为靶位进行疫苗研制可能是预防金黄色葡萄球菌感染的有效途径。

目前已有学者用大肠杆菌表达金黄色葡萄球菌clfA基因，为下一步研制基因工程疫苗奠定了研究基础。但是以其作为载体研制的疫苗存在着可能保持侵袭性和毒性的问题，在应用于儿童、老人和免疫缺陷者时受到了限制。

发明内容

本发明是要解决目前使用大肠杆菌作为宿主表达clfA基因，研制基因工程疫苗存在侵袭性和毒性问题，提供导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法。

本发明导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：一、提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA；二、以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，以MG-CLaF和MG-CLaR2为引物，进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得clfA基因；四、采用质粒提取试剂盒提取保存于大肠杆菌JM109中的质粒pMG36c；五、分别对clfA基因和质粒pMG36c进行双酶切，将酶切后的clfA基因和质粒pMG36c用连接试剂盒进行连接，得连接产物；六、将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，采用氯霉素筛选转化子，完成重组质粒pMG36c-ClfA的构建；七、将重组质粒pMG36c-ClfA电转化乳酸乳球菌MG1363，即完成导入clfA基因的乳酸乳球菌基因工程菌株的构建；其中步骤一中PCR引物MG-CLaF的序列为5′-GCGGTCGACATGAATATGAAGAAAAAAG-3′，引物MG-CLaR2的序列为5′-TTACCCGGGCAACCTACCTTACACCCT-3′。

本发明以乳酸乳球菌作为载体表达clfA基因，可用于研制基因工程疫苗，安全、无致病性。基因工程疫苗以其作为载体，可避免用病原菌作为宿主的活菌疫苗存在的侵袭性和毒性问题，这有利于在儿童、老人和免疫缺陷者中应用。

以大肠杆菌作为宿主表达clfA基因，研制的疫苗存在着可能保持侵袭性和毒性的问题，在应用于儿童、老人和免疫缺陷者时受到了限制。而乳酸乳球菌是公认的食品级安全微生物，以其作为载体表达clfA基因而构建的疫苗，具有比大肠杆菌所不具有的优势。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。