[发明专利]一种副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地说涉及一种副溶血性弧菌的检测试剂盒及其检测方法，可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、出入境检验检疫机构、疾病预防控制机构等对水产食品中的副溶血性弧菌的检测和监测。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是一种嗜盐性细菌，隶属弧菌科中的弧菌属，1950年在日本发生的一次食物中毒事件中发现并分离得到。它主要存在于海水、鱼、虾、贝类和腌醉制生食动物性海产品中。其引起的食物中毒，临床上以腹痛、呕吐、腹泻等为主要症状。目前，在我国沿海城市副溶血性弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件中所占比例已经超过沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌等，位居首位。而且副溶血性弧菌所致食物中毒也呈世界性分布，发病呈上升趋势。美国和欧盟等国家对进口养殖鱼类，虾类以及其相关加工制品都要求副溶血性弧菌不得检出。因此，检测水产品中的副溶血弧菌对于食物中毒的预防、水产食品的安全监测及市场健康有序运行具有重要意义。目前，针对副溶血性弧菌的检测大多都采用PCR、实时定量PCR、DNA探针和ELISA等方法，不仅有成本高、耗时长、灵敏度低等缺点，而且无法实现高通量处理样品，不能满足诸多食品安全监测机构的需要。因此，副溶血性弧菌的检测迫切需要发展快速、简便、可靠、实用、高灵敏度和高特异性的高通量检测方法。

环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)技术是Notomi于2000年报道的一种等温核酸扩增方法。它利用6种特异性引物，在链置换活性的DNA聚合酶的作用下完成DNA的体外扩增，15min-1h之内扩增效率就可达到109-1010个拷贝，其灵敏度是普通PCR方法的10-100倍。LAMP法不需要昂贵的实验设备，只需要60-65℃的水浴即可完成，且通过肉眼观察浊度或颜色变化就可判读结果。具有简便、快速、成本低廉、高灵敏度等特点。该技术在临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测以及动物胚胎性别鉴定等方面得到广泛应用。目前，LAMP技术应用于副溶血性弧菌的检测已有相关报道，检测基因涉及到tlh，tdh，trh，toxR基因。虽然该技术仅需1h内就可以完成检测，但是应用在对实际样品中的副溶血性弧菌靶基因诊断时，繁杂的样品前处理过程影响了该技术的检测效率。

免疫磁分离(Immonumagnetic Separation，IMS)技术是一种用来做细胞分离和微生物富集捕获的样品前处理方法。IMS可以有效的富集目的细胞，并有效的去除食品样品或临床样品中的抑制因子，缩短增菌时间，是有效的样品前处理方法。

与单纯的LAMP检测技术相比，采用IMS进行样品液前处理，可以有效的富集目的菌，缩短增菌时间，去除食品样品中的环境抑制因子，为后续的检测提供便利、节省时间、提高灵敏度。目前，采用免疫富集和LAMP技术联合使用的报道多见于病毒类的研究，如甲型流感病毒。目前尚未有采用IMS-LAMP对副溶血性弧菌进行高通量检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，使其具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高等优势，为各级食品安全检测机构实现对副溶血性弧菌的快速、准确检测和监测提供技术支持。

本发明需要解决的技术问题在于：提供一套副溶血性弧菌的检测方法，该方法结合免疫学方法和分子技术，可直接从复杂样品中检测副溶血性弧菌。

本发明需要解决的技术问题还在于，提供一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物，为副溶血性弧菌检测试剂盒的高灵敏度和高特异性提供保障。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

这种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于它包括：

(1)免疫富集反应体系组分：

偶联了副溶血性弧菌多克隆抗体的直径1.0-2.8μm免疫磁珠；含0.02％w/v叠氮化钠、以及含0.1％w/v牛血清白蛋白的pH为7.4的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠保护液；含有1％w/v牛血清白蛋白的pH7.4为磷酸盐缓冲液的免疫磁珠工作液；含三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液0.05mol/L、pH为6.4免疫富集反应液；含0--0.1％Tween-20免疫富集洗脱液。

(2)环介导等温核酸扩增体系组分：