[发明专利]新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及新型鸭呼肠孤病毒重组σB蛋白抗原的制备及其在检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体中的应用。 

技术背景

鸭出血性坏死性肝炎是由呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)引起的各种品种鸭的一种以肝脏不规则坏死和出血混杂为主要特征的疫病。不同品种鸭均易感，日龄愈小或并发感染时其发病率死亡率愈高，以5～10日龄居多，病程5～7d，发病率5％～20％、死亡率2％～15％。该痛在我国南方水禽饲养区广泛流行，疫区有逐年扩大的趋势，给水禽养殖业造成一定的经济损失。 

NDRV的代表株为NP03分离株，其S3基因的序列特征在于：根据DNAStar5.0软件包中MegAlign基因序列比较分析软件的Clustal W算法，所述的NDRVNP03分离株S3基因(GenBank登录号：GQ888710)与番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)89330株S3基因(GenBank登录号：AJ243881)、禽呼肠孤病毒(Avain reovirus，ARV)176株S3基因(GenBank登录号：AF059720)编码区核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别为68.0％，66.1％；70.4％，69.3％。 

目前，除了血清中和试验可用于检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体外，尚无其它检测方法，虽然中和试验是抗体检测的经典方法，特异性好，但操作烦琐，不适于兽医临床及基层应用。另外，利用NDRV全病毒作为诊断抗原时，会与抗番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)的血清样品产生非特异性交叉反应。利用原核表达系统表达外源蛋白是一种简便和高效的方法。原核表达系统生产的一些基因工程蛋白可保持必要的抗原性，能够用于病毒感染抗体的检测。研究表明，新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白即属于此类蛋白，因此应用基因工程σB蛋白作为抗原，能够建立检测方法用以鉴别NDRV、MDRV全病毒感染的血清抗体，这将为应用基因工程疫苗预防和控制NDRV提供重要的技术支撑。 

发明内容

本发明的目的在于提供新型鸭呼肠孤病毒重组σB蛋白抗原的制备及其在检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体中的应用； 

本发明是通过如下技术方案来实现的： 

新型鸭呼肠孤病毒重组σB蛋白抗原，该重组原核表达抗原为His前导肽与S3基因编码σB蛋白的融合蛋白； 

该新型鸭呼肠孤病毒σB重组蛋白抗原的制备方法是： 

a、设计扩增NDRV NP03分离株S3基因的特异性引物： 

b、NDRV NP03分离株培养及RNA提取： 

c、NDRV NP03分离株S3基因的RT-PCR： 

d、原核表达载体pET-30a-C(+)-NP03-σB的构建： 

e、NDRV σB蛋白的诱导表达 

f、重组蛋白的纯化 

g、重组σB蛋白纯化后的复性 

h、纯化后重组σB蛋白含量的测定 

i、重组σB蛋白活性的Western-blot检测 

将上述重组蛋白应用在间接ELISA检测鸭血清抗NDRV抗体。 

本发明以新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)RNA为模板，通过反转录聚合酶链式反应扩增获得NDRV S3基因编码区核苷酸全序列，并定向亚克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-30a-C(+)融合表达载体，转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞后用IPTG诱导表达，经Ni-NTAAgarose纯化，包涵体复性，获得表达的NDRVσB重组蛋白抗原。该蛋白的表达形式是融合蛋白(His-σB)，分子量约为44kU；经免疫印迹(Western-blot)检测表明该蛋白具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。本发明提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体时无散毒危险、稳定性好，灵敏度高、可实现工业化生产、成本低的原核表达抗原及其制备方法。应用该表达蛋白为包被抗原的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)可检测鸭血清中的抗NDRV抗体。 

本发明的优点：①由于该检测抗原是NDRV重组原核表达的σB蛋白，并非全病毒，因此应用该抗原进行检测时绝无散毒危险。②可用于鉴别NDRV、 MDRV全病毒感染的血清抗体。③作为间接ELISA抗原检测新型鸭呼肠孤病毒病抗体，其检测敏感性高，特异性强，无交叉反应。④生产工艺先进、性能稳定、生产成本低，产品付加值高，适合工厂化生产，市场应用前景广。 

附图说明