[发明专利]新型鸭呼肠孤病毒重组σB(SigmaB)蛋白抗原、制备方法及应用

权利要求书

1.新型鸭呼肠孤病毒重组σB蛋白抗原，其特征是：该重组原核表达抗原为His前导肽与S3基因编码σB蛋白的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒σB重组蛋白抗原的制备方法，其特征是：

a、设计扩增NDRV NP03分离株S3基因的特异性引物：

NDRV-NP03-S3F(上游引物)：5’-TGCAAGGATCCATGGAGGTGCGTGTGCC-3’

NDRV-NP03-S3R(下游引物)：5’-ACCCAGGTCGACTTACCACCTAC-3’

b、NDRV NP03分离株培养及RNA提取：

取NDRV NP03分离株种毒经尿囊腔途径接种于12日龄非免疫番鸭胚，37℃温箱孵育，收集48h-72h之间番鸭胚尿囊液，离心后取上清备用；NDRV RNA提取按Trizol试剂盒说明书进行；提取的RNA用于RT-PCR；

c、NDRV NP03分离株S3基因的RT-PCR：

(1)NDRV NP03的反转录

在PCR反应管中分别加入7μL已制备的RNA，加入1μLNDRV-NP03-S3下游引物(20pmol)，70℃热吸附10min，冰浴10min，继续加入5×First Standing Buffer4μL，10mM dNTPs 2μL，0.5μL反转录酶(M-MLV)5u(单位)/μL，0.25μLRNA酶抑制剂(40u)，用无RNA酶7水调至总体积20uL，瞬时离心混匀；反应程序：30℃10min，37℃60min，99℃5min；

(2)NDRV NP03 S3基因的PCR

PCR反应体系(50μL体系)：以制备好的cDNA2μL作模版，加入相应的上、下游引物(20pmol)各1μL，2.5mM dNTPs4μL，10×Buffer 5μL，rTaq1μL，灭菌水36μL，反应体系50μL；在PCR扩增仪内进行扩增，扩增条件为95℃5min，94℃1min，53℃1min，72℃2min，35个循环，最后72℃延伸10min结束；

d、原核表达载体pET-30a-C(+)-NP03-σB的构建：

(1)PCR产物经纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆直接连接于pMD18-T载体，连接产物转化E.coil JM109感受态细胞，挑取单克隆，进行PCR鉴定；

(2)以PCR鉴定正确的阳性克隆再进行PCR扩增，PCR产物用DNA纯化试剂盒进行纯化后，经BamH I、Sal I双酶切，回收目的片段并亚克隆于表达质粒pET-30a-C(+)的BamH I和Sal I酶切位点之间，构建重组表达质粒pET-30a-C(+)-NP03-σB，转化感受态宿主菌JM109，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。

e、NDRVσB蛋白的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌，挑取单克隆接种于5mL(含100ug/mL卡那霉素)的LB培养基中，37℃170r/min培养过夜；取0.5mL接种于5mL LB培养基中，37℃220r/min培养至OD₆₀₀0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度0.1mmoL/L，在37℃下培养8h，收集菌体，以6000g离心2min，去上清液，将沉淀用PBS洗涤1次，再以6000g离心2min，去上清液，1mL PBS重悬，超声裂解，4℃12000g离心30min，分别取一定量的上清以及用PBS重悬的沉淀，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀后，于沸水中煮沸5min，做为SDS-PAGE电泳上样样品；以诱导含空质粒pET-30a-C(+)的BL21(DE)3作对照；

f、重组蛋白的纯化

(1)待纯化样品的制备：

按已经优化的表达条件，表达NDRV NP03分离株重组σB蛋白菌液1000ml，收获菌液4℃，以8000rpm/min，离心20min，菌体沉淀用TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)洗涤3次，沉淀用TE溶液重悬起来；

裂解菌体获取包涵体沉淀：对菌体进行超声波破碎，超声处理必须于冰浴条件下进行；超声条件：800W，工作10S，间隔10S，重复一定次数，以4℃，10000rpm离心10min，弃上清，沉淀即为包涵体；

包涵体的裂解及可溶性蛋白的回收：获得的不溶性包涵体用包涵体洗涤液(20mM Tris-HCl[pH8.0]，5mM EDTA，2M尿素)洗涤2次，将该包涵体沉淀溶解于含8M尿素Tris-HCl缓冲液，置于冰上2h，然后4℃过夜，以12000rpm，4℃离心20min，除去不溶性沉淀，取上清即为可溶性包涵体蛋白，经0.45μm孔径小过滤器过滤，-80℃冻存备用；

(2)重组σB蛋白的亲合层析纯化：

①用25ml新鲜配制的预冷结合缓冲液(20mM Tris-HCl[pH7.9]，10mM咪唑，0.5MNaCl，8M尿素)冲洗并平衡His镍柱；

②10ml可溶性包涵体蛋白溶液(再经0.22μm过滤孔径小过滤器过滤)重悬平衡后的His蛋白纯化介质，置于50ml洁净离心管中，室温充分感作30min，然后重新上柱，弃掉流出液，流速为10倍柱体积/小时(柱体积，即树脂纯化柱的体积，2m1，以下均同)；

③使用15倍柱体积的结合缓冲液(含8M尿素)冲洗柱子，收集流穿峰；

④使用3倍柱体积的新鲜配制的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl[pH7.9]，0.5M咪唑，0.5M NaCl，8M尿素)洗脱，收集洗脱峰，按500μl量分装于洁净Eppendorf管内；

⑤纯化柱的再生与保存：依次使用8倍体积的结合缓冲液和5倍柱体积的自备去离子水洗涤后，用3倍柱体积的自备20％乙醇平衡(乙醇要将介质浸沉)，4℃保存；

g、重组σB蛋白纯化后的复性

将纯化好的表达蛋白(含8M尿素)装入按常规方法处理好的透析袋(截留分子量：14000Da)后，置于TGE透析液(50mmol/L Tris-HCl，0.5mmol/LEDTA，50mmol/LNacl，10％甘油，1％甘氨酸，pH 8.0)中，4℃条件下反复透析，8小时换一次透析液，换液三次；透析后用蔗糖粉末覆盖于透析袋表面对蛋白溶液进行浓缩，浓缩至原体积的1/4；即为纯化的重组NDRVσB蛋白，-80℃冻存备用；

h、纯化后重组σB蛋白含量的测定

采用紫外线吸收法定量蛋白质。将待检样品适当稀释后，同时以BioPhotometer分光光度计(Eppendorf)Bradford法测定该蛋白质与考马斯亮兰G250结合反应后，产生的有色化合物吸收峰595nm处的OD值，同时用考马斯亮兰G250作为空白对照，显示蛋白含量；NDRV-σB/His纯化蛋白的质量浓度为≥1.0mg/ml；

i、重组σB蛋白活性的Western-blot检测

将复性纯化好的重组σB蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(NC)上，用含有3％(w/v)BSA的TBS(pH＝8.0)4℃孵育过夜封闭NC膜；用TTBS在摇床温和震荡洗3次，每次间隔10min，再加入用含有1％(w/v)BSA稀释(1∶100)的NDRV多克隆番鸭血清，室温摇床温和作用90min；TTBS在摇床温和震荡洗3次，再加入用含有1％(w/v)BSA稀释(1∶1500)的HRP标记的兔抗鸭IgG二抗，室温摇床温和作用60min；TTBS在摇床温和震荡洗3次，吸静余液，置于DAB显色液中显色，结果在约44kU处观察到了特异性的反应条带。

3.根据权利要求2所述的新型鸭呼肠孤病毒σB重组蛋白抗原的制备方法制备的新型鸭呼肠孤病毒σB重组蛋白在间接ELISA检测抗新型鸭呼肠孤病毒病抗体中的应用。