[发明专利]一种猪α-干扰素的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于治疗猪感染病领域，主要是提供了一个高效简单的干扰素分泌、分离纯化方法。

背景技术

干扰素最早被分为Ⅰ型与Ⅱ型，Ⅰ型曾被称为白细胞干扰素， Ⅱ型曾被叫成纤维细胞干扰素。 后来发现Ⅰ型干扰素中还有二种成分，虽然它们共用受体成分，但二者的结构不同，免疫原性也完全不同，于是将Ⅰ型又分为α及β两类。其中IFN-α是２０个结构相关的分子量约为 18KDa的多肽家族，每个由独立的基因编码；IFN-β是个单基因产物，是分子量20KDa的糖蛋白。后来把Ⅱ型则定为γ类，IFN-γ是由大约21-24KDa的亚基组成的以同源双体形式存在的糖蛋白，对56℃、pH2和0.1%SDS敏感。因此，干扰素就分为α、β、γ三大类。近年来，还发现了ω、τ等类型的干扰素。

Ⅰ型干扰素又称抗病毒干扰素，其生物学活性以抗病毒为主；Ⅱ型干扰素又称免疫干扰素，其生物学活性以免疫调节为主。常规发酵表达干扰素的方法，在回收干扰素时要进行菌体破碎。菌体破碎存在以下不足之处：一是成本高，操作复杂；二是菌体破碎工艺对干扰素有一定破会作用，使干扰素活性和稳定性受到影响；三是菌体破碎会产生很多杂蛋白以及其他杂质，混合在干扰素中，难于分离，使干扰素产品纯度下降，生物活性下降。如果是用大肠杆菌作为表达体系，菌体破碎会使内毒素混合在干扰素中，给用药安全造成一定风险。若从发酵液中回收干扰素时，通常采用盐析法，盐析法存在以下不足之处：一是盐析法没有选择性，杂蛋白也会被沉淀混合在干扰素中，使干扰度纯度下降；二是盐析法对干扰素活性存在一定影响，部分干扰素在沉淀过程中因为结构被破坏而散失活性。猪α-干扰素主要用于蓝耳病毒、猪瘟病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒、流感病毒、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒等感染，同时还可调剂动物机体免疫功能。

发明内容

本发明的目的旨在简化生产工艺，降低生产成本，获得高活性、高稳定性重组猪α-干扰素产品。

本发明所提供的生产方法是：一是用甲醇的混合物生产干扰素；二是采用多效超滤提纯干扰素。根据干扰素分子量选择不同截留分子量的超滤膜做成过滤器，通过过滤使发酵液中大于干扰素分子量的杂蛋白和杂质、小于干扰素分子量的杂蛋白、无机盐以及水被出去，仅保留干扰素和少量的水，冷冻干燥得到的干扰素成品纯度高、活性高、稳定性好。

一种猪α-干扰素的生产方法，其步骤包括：

一、用甲醇的混合物生产干扰素

第一步、备料：单克隆、甘油、甲醇的混合物；

第二步、单克隆接种到一级种子液，培养17～20h；

第三步、按XX：YY=1:10比例二级接种于三角烧瓶，培养4～8h；

第四步、发酵

pH5.0，温度20℃，DO＞35%，当溶氧上升到10～15后；转速加50%甘油；待甘油耗尽，溶氧再次上升后；

第五步、甲醇的混合物诱导得到α-干扰素

用含甲醇的混合物以转速1开始诱导，诱导48h后，得到α-干扰素。

二、纯化α-干扰素

第六步、α-干扰素液体经二级串联过滤器过滤，一级串联过滤器串接二级串联过滤器，一级串联过滤器滤膜孔径为0.45μm、二级串联过滤器滤膜孔径为0.22μm；

第七步、滤液通过22KD超滤系统过滤；

第八步、所得滤液再通过18KD超滤系统进行浓缩；

第九步、冷冻干燥后得到的较纯的α-干扰素。

本发明采用改造后的毕赤酵母表达体系分泌表达猪α-干扰素，通过优化发酵工艺，简化纯化工艺，获得高表达、高活性、高稳定性，且及具产业化价值的猪α-干扰素。

具体实施方式

实施例：

1、干扰素的产生

取单克隆，接种到一级种子液中，培养17～20h，按1:10比例二级接种于三角烧瓶，培养4～8h，上罐发酵，pH5.0，温度20℃，DO＞35%，当溶氧上升到10～15后，转速加50%甘油。待甘油耗尽，溶氧再次上升后用含甲醇的混合物以转速1开始诱导，诱导48h后，检测产物浓度。

2、干扰素的纯化 

取发酵液50L，经过二级串联过滤器过滤，滤膜孔径分别为0.45μm和0.22μm，将滤液通过22KD超滤系统过滤，所得滤液再通过18KD超滤系统进行浓缩，待浓缩液体积为0.5L时停止浓缩，将浓缩液中样品含量合格后无菌分装到西林瓶，冷冻干燥。

以上实施例仅为了对本发明作进一步的说明，而本发明的范围不受所举实施例的局限。