[发明专利]一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶A2的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物提取领域，具体的说，涉及从一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶A₂的方法。

背景技术

磷脂酶A₂(phospholipase A₂，PL A₂)广泛存在于蛇毒、蜂毒和蝎毒的动物毒液以及哺乳动物的胰腺液中，它是一种Ca²⁺依赖性酶，能专一的催化甘油磷脂的第二位脂酰键的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。该酶主要由一类结构相似、分子量在14KDa左右的蛋白家族组成，一般含有6到7对二硫键。磷脂酶A₂几乎存在于所有毒蛇的毒液中，除了酶活性外，还具有多种生理、药理作用，如心脏毒，细胞毒，肌肉毒，神经毒和神经生长因子等，并有抗凝血、溶血、降血压、抗血小板聚集、诱导形成水肿及引起惊厥等作用。此外，磷脂酶A₂还具有抑制细菌生长、诱导细胞凋亡和阻值HIV病毒进入宿主细胞的功能，是研究生物膜、脂蛋白中磷脂结构和酶的非均相催化机理的重要工具酶。从20世纪50年代首次对眼镜蛇蛇毒的磷脂酶A₂进行研究开始(Wittcoff et al，1951)，迄今已有100多种磷脂酶A₂被纯化出来，各种实验表明不同种类的毒蛇含有的磷脂酶A₂不尽相同，即使是同一种类的毒蛇，也可能由于生存环境的不同，而导致毒液中的磷脂酶A₂的结构和活性有较大的差异。磷脂酶A₂这种特有的化学性质和复杂的生理功能，不仅对其进行生物学研究、结构特征及毒理研究具有重大的理论意义，而且作为药物在治疗肿瘤、心血管疾病等方面也有着重要的应用前景。

白唇竹叶青为有毒蛇，主要见于广州、四川、贵州、广西、福建、云南等地。白唇竹叶青蛇毒属于血液循环毒，因为其排毒量较小，人被咬伤后不会马上致命，但是如果不及时采取治疗措施，也会有生命危险。被白唇竹叶青咬伤后，伤者多表现为伤口剧烈疼痛，流血不止，患肢周围红肿，局部地方还会出现水疱、血疱，严重者还有可能出现吐血、便血等症状。近年来对其毒液的研究报道主要有降纤酶、类凝血酶、5’-核苷酸酶等，尚未有报道从白唇竹叶青蛇毒中分离制备磷脂酶A₂的方法及其磷脂酶A₂酶学性质的研究。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶A₂的方法。

本发明目的是这样实现的：一种白唇竹叶青蛇毒中提取磷脂酶A₂的方法，其特征在于：按如下步骤进行：

(1)白唇竹叶青蛇毒预处理：收集毒液，将毒液冷冻干燥成粉末状备用，取粗毒冻干粉0.3～1g，溶解于5ml pH 5.2-5.8，0.025～0.05mol醋酸钠缓冲液中，冷冻离心，取上清液待用；

(2)CM-Sephadex C-50阳离子交换层析：用pH 5.2-5.8，0.025～0.05mol/L醋酸钠缓冲液平衡CM-Sephadex C-50阳离子层析柱；将步骤(1)中上清液上样，用浓度范围在0～0.5mol/L NaCl的上述缓冲液梯度洗脱，检测波长：280nm，流速：0.5～1ml/min，收集3ml/管，收集活性最强的峰I，冷冻干燥；

(3)Sephadex G-75凝胶层析：用pH 7.5～8.0，0.01～0.03mol/L Tris-HCl buffer平衡Sephadex G-75柱，将步骤(2)中收集的冻干样品用相同缓冲液溶解后上样，检测波长：280nm，流速0.15ml/min，收集2ml/管，测各峰磷脂酶活性，收集活性最强的峰IV，冷冻干燥；

(4)Q-Sepharose FF预装柱层析：用pH 7.5～7.8，0.02～0.05mol/L的Tris-HC1缓冲液平衡Q-Sepharose FF预装柱，将步骤(3)中制得冻干样品用上述缓冲液溶解后上样，用浓度范围在0～0.5mol/L NaCl的上述缓冲液梯度洗脱，流速1ml/min，1ml/管，收集活性峰II，冷冻干燥即得纯品。

上述步骤(1)中采用咬皿挤压法收集毒液，其中冷却离心采用3000～5000r/min离心10～15min。

层析过程中均检测OD280nm吸光值，采用卵黄平板法测定磷脂酶活性。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量大小。