[发明专利]一种抗血栓酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗血栓酶及其编码酶的基因

a)、其氨基酸序列如SEQ工D NO：2所示。

b)、其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利1中的抗血栓酶在抗血小板凝聚、溶栓和抗血栓形成方面的应用。

3.一种抗血栓的药物，其特征在于该药物含有权利1中所述的具有抗血栓酶作为活性成份。

4.用重组技术，采用大肠杆菌系统制备权利1中抗血栓酶的方法。

a.用6M Urea 200mMNaCl20mMTris-HClpH8.0溶解包涵体，室温搅动2h。12000rpm离心10min，弃去沉淀。测定上清蛋白浓度，用溶解液稀释蛋白浓度于0.5mg/ml装于透析袋中，依次分别在6MUrea200mMNaCl20mMTris-HClpH8.0，3MUrea200mMNaCl20mMTris-HClpH8.0，1MUrea200mMNaCl20mM Tris-HCl pH8.0，1M urea20mMTris-HClpH8.0，20mMTris-HClpH8.0溶液中透析10hr，每次透析阶段换液2次。

b.将透析产物离心后，弃去沉淀，上清用0.22um的过滤膜过滤后作为上样的样品。将样品上样于SP Sephrose后，用0-1M的NaCl 20mMTris-HCl pH8.0溶液50个柱体积梯度洗脱，流速为2ml/min收集各洗脱份，SDS-PAGE鉴定。将含有重组目的蛋白成份的组份混合起来，透析到20mMTris-HCl pH8.0中，透析过夜。将样品上样于resource 15S柱上，用100个柱体积0-0.5M的NaCl20mMTris-HCl pH8.0溶液梯度洗脱，收集洗脱部份SDS-PAGE鉴定。c.将含有的重组蛋白的组份收集起来。用10kD的浓缩管，浓缩重组蛋白，使蛋白的浓度不低于1.5mg/ml，用G-75层析柱分离纯化，洗脱液为20mMTris-HCl pH8.0，收集各分离峰。