[发明专利]在双链DNA片段末端产生预定粘性末端的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术以及基因重组领域；更具体地，本发明涉及在双链DNA片段末端产生预定粘性末端的方法。

背景技术

人工合成生命的诞生是合成生物学领域里程碑式的成就，标志着科学家已经能够合成人工设计的全基因组。在全基因组的合成过程中，文特课题组发展出了一系列的DNA合成组装拼接的关键技术，这些技术将开创人类改造和设计生命的新时代。DNA合成相关技术的发展已经在合成生物学的其他领域产生了重要影响，例如合成青蒿素药物前体，合成复杂的遗传回路，抗生素的组合生物化学合成。在巨大的科学远景和经济预期下，DNA合成相关技术将会飞速发展。而DNA合成相关技术的完善和发展将极大推动合成生物学的繁荣。

文特课题组发展的体外酶法拼接技术，以及更早期的不依赖特定序列和连接酶的体外重组克隆技术，都能够实现在体外有序同步拼接多个片段，这大大缩短了基因组的拼接时间，在合成人工设计的全基因组中优势明显。而且能够为大片段基因和基因簇的研究和改造提供技术可行性。这对那些相对较大的人类和动植物的基因功能研究和改造特别有价值，对那些相对较大的微生物基因簇的功能研究和改造同样有价值。不过这些技术要求被拼接的DNA要存在较长的(15-100碱基对)末端同源序列作为重组连接的连接点。如果能够摆脱拼接技术对末端长同源序列的要求，就可以增加连接点选择的灵活性，简化拼接连接的设计，扩大拼接技术实用的材料来源范围。

限制性核酸内切酶被广泛用来切割双链DNA分子，产生可以用来连接的4碱基突出粘性末端，最常用的IIP型限制性内切酶一般识别对称的回文序列，并在识别位置处切割双链DNA分子，产生的回文粘性末端可以被重组连接，但是连接的次序和方向不能够完全确定，在这种重组连接双链DNA反应过程中有很多非目的产物。

IIS型限制性内切酶可以在识别位点的邻旁确定位置切割双链DNA分子，可以产生非回文的粘性末端。利用这种内切酶可以实现在体外定向定序高通量连接双链DNA分子，还可以实现重复序列较多的基因的合成。不过在这个技术中，为了使IIS酶特异性地作用在DNA双链分子的末端，仅在双链DNA分子末端产生可用于连接的粘性末端，在基因合成过程中设计连接实验的时候需要避免基因内部有多余的酶切位点的存在，这就限制了基因合成的连接点的选择和设计，使得这个方法在合成一些大的基因片段的时候很不方便。

所以人们借助RecA辅助的酶切技术来保护DNA的内部多余酶切位点，但是这个技术涉及较多步骤不仅复杂，而且这个技术中使用的内切酶的识别位点与切割位点只有1-2个碱基的差距，不能够用来去除酶切制备双链DNA时末端通常具有的多余酶切位点。另外也有使用长的识别序列的人工设计的杂合内切酶来减少内部酶切位点带来的限制，但是这个技术中的识别位点与切割位点也只有1-2个碱基的差距，不能够用来去除酶切制备双链DNA时末端通常具有的多余酶切位点。这两个技术中连接点的选择和设计的灵活性都有一定的限制。

综上，本领域还有必要对于长链DNA的拼接方法进行改进，以实现方便、快捷、准确的长链DNA连接。

发明内容

本发明的目的在于提供在双链DNA片段末端产生预定粘性末端的方法。

在本发明的第一方面，提供一种在双链DNA片段末端产生预定粘性末端序列的方法，包括：

(i)提供一种双链DNA片段，其DNA链(较佳地为两条链各自)包括式(I)结构：

B…X-Y          (I)；

其中，B为核酸内切酶识别位点序列；B序列与Y序列的修饰状态不同，所述的核酸内切酶特异性识别修饰状态如B的位点序列；

X为核酸内切酶切割位点序列；该切割位点序列经所述核酸内切酶切割后形成预定粘性末端序列；

Y为与所述预定粘性末端序列相连接的来自双链DNA片段的非粘性末端序列(也称为内部序列，该序列的末端需连接预定粘性末端)；

…表示B与X-Y之间存在的化学键或碱基；

-表示化学键；

(ii)利用所述的核酸内切酶切割步骤(i)的双链DNA片段，从而获得末端(一个或两个末端)为预定粘性末端序列的双链DNA片段。

在一个优选例中，式(I)为：5’B…X-Y  3’。

在另一优选例中，当式(I)存在于两条DNA链时，预定粘性末端序列相同或不同；较佳地为不同。

在另一优选例中，B或X各自独立地由若干个碱基组成，一般1-10个，如1、2、3、4、5、6或8个。