[发明专利]在双链DNA片段末端产生预定粘性末端的方法

权利要求书

1.一种在双链DNA片段末端产生预定粘性末端序列的方法，包括：

(i)提供一种双链DNA片段，其DNA链包括式(I)结构：

B…X-Y    (I)；

其中，B为核酸内切酶识别位点序列；B序列与Y序列的修饰状态不同，所述的核酸内切酶特异性识别修饰状态如B的位点序列；

X为核酸内切酶切割位点序列；该切割位点序列经所述核酸内切酶切割后形成预定粘性末端序列；

Y为与所述预定粘性末端序列相连接的来自双链DNA片段的非粘性末端序列；

…表示B与X-Y之间存在的化学键或碱基；

-表示化学键；

(ii)利用所述的核酸内切酶切割步骤(i)的双链DNA片段，从而获得末端为预定粘性末端序列的双链DNA片段。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(i)之前，还包括扩增双链DNA片段的步骤：

(′i)提供待扩增双链DNA片段的上游和下游引物，所述的上游引物或下游引物中包括式(II)结构：

B…X-Y′(II)；

其中，Y′为与粘性末端序列相连接的且与Y的5’端1-60个碱基相同的序列；和

以包含Y序列的DNA作为模板，利用所述的上游和下游引物进行PCR扩增，获得包含式(I)结构的扩增产物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，B被包含在式(III)结构的Seq中：

Seq’-H-Seq    (III)；

其中，Seq是1-30个核苷酸的序列，Seq’为与Seq互补的序列；

H为Seq和Seq’之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq和Seq’不互补。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的基团修饰依赖性核酸内切酶选自：MspJI，FspEI，LpnPI，AspBHI，RlaI，SgrTI；且，

(1)当所述的基团修饰依赖性核酸内切酶是MspJI时：B为^*CNNR，其中R为G或A，^*C为预设的或已设的甲基化、羟甲基化；B与X-Y之间存在9个任意碱基；X为4个碱基的序列；或

(2)当所述的基团修饰依赖性核酸内切酶是FspEI时：B为C^*C，其中^*C为预设的或已设的甲基化、羟甲基化；B与X-Y之间存在12个任意碱基；X为4个碱基的序列；或

(3)当所述的基团修饰依赖性核酸内切酶是LpnPI时：B为C^*CDG，其中D为A或G或T，^*C为预设的或已设的甲基化(mC)、羟甲基化(hmC)；B与X-Y之间存在10个任意碱基；X为4个碱基的序列；或

(4)当所述的基团修饰依赖性核酸内切酶是AspBHI时：B为YS^*CNS，其中R为G或A，Y为C或T，S为C或G，N为A或C或G或T，^*C为预设的或已设的甲基化(mC)、羟甲基化(hmC)；B与X-Y之间存在9个任意碱基；X为4个碱基的序列；或

(5)当所述的基团修饰依赖性核酸内切酶是RlaI时：B为S^*CW，其中S为C或G，W为A或T，其中^*C为预设的或已设的甲基化、羟甲基化、或糖化羟甲基化修饰的胞嘧啶；B与X-Y之间存在12个任意碱基；X为4个碱基的序列；或

(6)当所述的基团修饰依赖性核酸内切酶是SgrTI时：B为C^*CDS，其中D为A或G或T，S为C或G，其中^*C为预设的或已设的甲基化、羟甲基化、或糖化羟甲基化修饰的胞嘧啶；B与X-Y之间存在12个任意碱基；X为4个碱基的序列。

5.一种制备长链DNA的方法，包括：

(a)将待制备的长链DNA分成两条或两条以上的序列片段，依次为序列1、...、序列n；其中n为等于或大于2的正整数；

(b)针对步骤(a)分段的每一序列片段，以权利要求1-4任一所述的方法分别制备末端为预定粘性末端序列的双链DNA片段；所述的预定粘性末端序列来自于各序列片段的末段，且针对序列n-1获得的双链DNA片段的3’末端预定粘性末端序列与针对序列n获得的双链DNA片段的5’末端预定粘性末端序列相互补；

(c)将步骤(b)获得的末端为预定粘性末端序列的双链DNA片段进行连接，从而获得长链DNA。