[发明专利]水稻稻曲病菌毒素Ustiloxin A的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取并纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A的方法。

背景技术

稻曲病是一种世界性水稻真菌病害，其病原菌Ustilaginoidea virens 侵染水稻穗部产生稻曲球。近年来，随着水稻栽培模式的改变，稻田氮肥施用量的增加，加上新型高产密穗型杂交稻的大面积推广，稻曲病的发生日趋严重。稻曲病不仅严重影响水稻的产量，更为严重的是稻曲病菌能产生对人畜有害的稻曲病菌毒素。

稻曲病菌毒素Ustiloxins是一类抗真核细胞有丝分裂的杂环肽，包含一个13员环，环中有一个乙醚键。1994，Koisoetal等首次国从稻曲球中分离得到了6种毒素，分别为Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D、Ustiloxin F和Ustiloxin E，并鉴定了其分子式与化学结构。其中Ustiloxin A的含量最为丰富且活性最强。

Suwa(1915)首先报道了稻曲球的水提液对兔子的毒性，Nakamura(1992)等报道食用了被稻曲病菌毒素污染的饲料能引起动物严重的肝肾疾病（代谢紊乱），1993通过电镜组织化学证明稻曲病菌毒素可引起老鼠肝、肾和尿道细胞凋亡和前胃溃疡.Koiso等(1994)发现，用Ustiloxin A进行一次性注射，可以使小鼠离体的肝细胞和肾管状细胞急剧坏死，并能遏制器官细胞有丝分裂或引起不正常的有丝分裂，这与用秋水仙素处理引起的症状相似。黄世文(2002)报道用稻曲病粒拌饲料喂家兔、白洛克小公鸡和本地母鸡，经35-84d喂饲，可引起死亡和内脏器官病变；用带稻曲病菌的谷糠喂猪，母猪出现产死胎、干尸胎和畸形胎等。随后大量研究结果表明，稻曲病菌毒素能够阻止微管蛋白的聚合反应，干扰细胞骨架的形成，并且对现有的微管蛋白具有解聚作用，继而抑制细胞的的有丝分裂，但它或由于不能穿透细胞膜而不具备细胞毒性，因而不会影响细菌或真菌的生长。目前研究认为，Ustiloxin A和Ustiloxin B还能够抑制多种人类肿瘤细胞的有丝分裂，对植物和动物细胞都有广泛的生物活性。

随着近年来稻曲病的发生越来越重，对稻曲病菌毒素研究也相继广泛开展，科研领域对稻曲病菌毒素标准品的需求量也越来越大，然而目前市场上并没有稻曲病菌毒素的标准品出售，这给科学研究带来了极大的不便。查阅相关文献，目前只有日本东京大学的Kobayashi 博士从稻曲球中分离纯化到了稻曲病菌毒素，该方法利用稻曲球作为毒素的来源，采用C18小柱、硅胶柱等多步净化手段，步骤比较繁琐、耗时。

稻曲病菌毒素的种类目前共鉴定有6种，然而稻曲病菌毒素Ustiloxin A是其中含量最多、活性最大的一种毒素，因此，本发明专利针对这一实际问题，建立一种新的，能够大规模、安全、高效的在实验室提取纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A的方法，具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容：

本发明的目的在于：针对目前市场上没有稻曲病菌毒素Ustiloxin A标准品出售，而现有的稻曲病菌毒素Ustiloxin A提取方法比较复杂等一系列现实问题，提供一种在实验室能够大规模、安全、高效的提取纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种水稻稻曲病菌毒素Ustiloxin A的提取纯化方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：

a)取稻曲球粉末或稻曲病菌毒素培养物粉末，加入其重量1/5的PEG，再加入其重量4-5倍的2%甲酸溶液，置于摇床，摇床条件为室温、200转/分钟，30分钟后取出，转速为8000转/分钟离心10分钟，取上清液；

b)滤渣中加入其重量等体积的甲醇，同上摇床条件，15分钟后取出，同上条件离心10分钟，取上清液；

c)合并步骤a和步骤b的上清液，蒸发浓缩获得毒素的粗提取液1；

d)先后用甲醇和5N 的氢氧化钠冲洗平衡阳离子交换柱，当溶剂液面到达氨基柱吸附层表面时，立即加入步骤c获得的毒素的粗提取液1，控制流速在1滴/秒，再先后用1/5样品体积的5%氨水和甲醇分别淋洗阳离子交换柱，最后以1/5样品体积的甲醇洗脱液洗脱下目标毒素，旋转蒸发浓缩获得粗毒素干粉；所述的甲醇洗脱液为含有5%甲酸的甲醇；

e)将粗毒素干粉溶于干粉重量10-20倍的甲醇溶剂中，通过半制备型高效液相色谱仪的分离，对照稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样峰值的保留时间收集得到毒素的粗提取液2；所述的甲醇溶剂中甲醇与水的体积比为2:8；