[发明专利]一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物的筛选方法领域，特别涉及一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法。 

背景技术

有机氯化合物由于其突出的持久性、生物积累性和生物毒性等特征而受到全世界的广泛关注。虽然目前很多国家已禁止了对有机氯农药的使用，但它们仍广泛的残留于农业土壤、水体以及食物当中，对人类健康造成巨大的威胁。由于微生物能够通过矿化、共代谢、浓缩等作用对有机氯农药进行特异性降解的优势明显，微生物原位降解修复技术是当前有机氯污染土壤的主流。 

固氮蓝藻主要是蓝藻门念珠藻目(Nostocales)鱼腥藻属(Anabeana)和念珠藻属(Nostoc)的多种丝状异型胞，能够在固氮酶作用下从大气中固定N2转变为NH4+等生源氮素。固氮蓝藻固氮作用主要应用于水稻田营养氮素的提供，对于水稻土肥力稳定，以及水稻生长和稻米产量增加具有重要的现实意义。近年来对固氮蓝藻具有降解有机氯化合物能力的发现，使得固氮蓝藻在稻田的应用具有显著的“固氮”和“降解”双重作用。因此对固氮蓝藻原位修复水稻土的研究具有不可替代的优势。 

一直以来，有关固氮蓝藻的科学研究主要集中在固氮藻种的固氮活性测定及其生理生化机制分析，固氮调控基因及固氮酶结构表征等 方面，有关藻种筛选的特别是抗逆性藻种的筛选研究还未深入，且针对固氮蓝藻对土壤污染物的降解研究也仅限于实验室的小试阶段，实验主要将培养于液体培养基中固氮蓝藻暴露于污染物中，通过批次实验来研究固氮蓝藻对某种污染物的降解效率，降解半衰期，降解动力学等参数。该方法简便易行，对掌握固氮蓝藻的降解特异性及其降解机理有很好的作用，但该方法并不能很好的解决筛选和分离具有降解功能藻种的技术难题，以实现原位微生物修复的现实意义。 

目前已有的藻类筛选技术主要集中在对能源藻种的筛选以及通过微生物平板筛选、离体筛选以及基因克隆等技术手段实现。微生物平板筛选方法虽然能够起到筛选的作用，但很难解决如固氮蓝藻生长需氧量等条件，且筛选效率较低，很难在短时间内筛选出大量的目标藻种；离体筛选和基因克隆虽然目标性强，能够快速筛选出所需的目标藻种，但其只有在前期鉴定出功能基因的基础上才能实验，且花费成本大，不利于原位技术的推广应用。 

发明内容

为了解决现有筛选方法中存在的难以满足固氮蓝藻生长需氧量条件、筛选效率较低等问题，本发明提供一种成本低，操作简便，效率高，特异性强，利于工程推广的具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法。 

本发明采用的技术方案是： 

一种具有多氯联苯降解功能固氮蓝藻的分离筛选方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤： 

1)配置无氯培养基，加入琼脂糖后灭菌，待冷却至60℃加入多氯联苯，混合均匀后倒入分离筛选装置中相应的筛选区中，冷却固定，作为筛选藻种的固体培养基； 

2)将采集至野外土壤中经过预培养的混合藻液进行离心分离，弃上清，用无氯培养基重悬细胞，混匀后得到所述混合藻液的浓缩液； 

3)将步骤2)中得到的混合藻液的浓缩液倒入步骤1)中的固体培养基上； 

4)将所述分离筛选装置于培养室恒温培养。 

本发明的具体原理为：多氯联苯的微生物降解的基本原理为脱氯或脱氯化氢，因此将混合藻液暴露于含有多氯联苯的无氯固体培养基中，因固氮蓝藻生长环境中缺乏生长所必须的氯离子，就会诱导具有潜在脱氯功能的固氮蓝藻降解多氯联苯脱氯或氯化氢，从而达到自身生长和多氯联苯降解的目的，因此能够脱氯的固氮蓝藻藻种得以存活且长势良好，藻种密度变大，无法脱氯的藻种难以存活或长势较弱或长势缓慢。 

本发明中使用的无氯培养基理论上只需不含氯离子，且能够提供固氮蓝藻生长所需的必要无机盐即可；本发明是以其他形式钙盐代替氯化钙，本发明优先选用磷酸二氢钙；本发明需将多氯联苯均匀分散于固体培养基中，达到理想的筛选目的。 

本发明具体推荐一种具有降解功能固氮蓝藻的分离筛选装置，包括可拆卸的平板底座和平板盒盖；所述的平板底座包括底板和桶体，所述底板和所述桶体通过卡扣固定连接；所述桶体内设有多个可拆卸 的环形培养基挡板，将所述底板分割成不同大小的环形筛选区，所述培养基挡板通过卡扣固定在所述底板上；所述平板盒盖上设有用于固定所述平板底座的固定装置和与所述培养基挡板配合使用的环形培养基定型模具，顶部设有隔板装置，所述培养基定型模具通过卡扣固定在所述平板盒盖上；所述培养基挡板内设有卡槽，所述平板盒盖上设有与所述卡槽相对应位置的固定体，所述固定体嵌入所述卡槽将所述培养基挡板和所述平板盒盖固定相连。