[发明专利]重组HPV16L2蛋白疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于重组蛋白制备领域，涉及重组HPV16L2蛋白疫苗及其制备方法，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）。

背景技术

人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）属乳多空病毒科，是无包膜的闭环双链DNA病毒。现已明确，高危型HPV如HPV16、18的持续感染与宫颈癌的发生密切相关，被确定为导致宫颈癌的主要病因，其中又以HPV16型最为常见（Bosch F X, J Natl Cancer Inst ,1995 ,87: 796–802.）。

中国专利“人宫颈癌的一种治疗性疫苗（专利号：ZL200810112765.9）”中，公开了人宫颈癌的治疗性的疫苗，该疫苗的活性成分为重组腺病毒，该疫苗是将包括HPV16mE67、HPV18mE67、HPV58mE67以及连接三者的短核苷酸片段的转录融合三基因片段插入Adeno-X的表达系统的病毒DNA中得到重组腺病毒载体，再将该腺病毒载体导入细胞中得到重组腺病毒。该治疗性疫苗虽然能引起宿主产生强烈的细胞和体液免疫反应，但以前的感染可能对疫苗的效果产生负面影响。

HPV16病毒样颗粒（Virus-Like Particles）由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2一起共同构成。研究表明，主要衣壳蛋白L1可以自组装形成病毒样颗粒结构（Virus Like Particles，VLPs），L1 VLPs可诱导机体产生高滴度的血清中和抗体，该抗体具有型别特异性，不同基因型的HPV L1 VLPs 之间没有或仅有微弱的交叉保护效果。近来的研究显示，不同型别HPV L1 VLPs的混合制剂在免疫时相互之间会产生竞争，导致疫苗整体免疫效果的下降(Ting Zhang,Vaccine, 2010, 28(19):3479-3487)且多个VLPs的混合制剂增加了接种蛋白剂量，加大了疫苗接种个体过敏的几率。大量的实验证实，HPV16L2蛋白的N端具有中和多种HPV基因型的交叉中和表位，是很有前景的候选宫颈癌疫苗（Kawana K，Virology,1998,245:353-359），然而，其免疫原性偏低制约了该疫苗的进一步应用。因此，提高HPV16L2蛋白免疫原性是决定该疫苗能否进入实用化阶段的重要因素。源于HIV-1 Tat的转导域多肽具有穿膜活性，可以将外源蛋白（融合或非融合）带入细胞内。有研究显示，转导域多肽可显著提高外源蛋白进入胞内的水平（Haibin Xia, Nature Biotechnology,2001, 19: 640-644）。

因此，在宫颈癌疫苗的领域，需要研发出一种将转导域多肽PTD的穿膜活性与HPV16L2蛋白的免疫原性协同作用，显著提高HPV16L2蛋白免疫原性的新型重组蛋白疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供重组HPV16L2蛋白疫苗及其制备方法；该重组HPV16L2蛋白疫苗将转导域多肽PTD的穿膜活性与HPV16L2蛋白的免疫原性协同作用，免疫原性较高。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

重组HPV16L2蛋白疫苗，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）。

进一步地，所述HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2Ne）是HPV16L2 1-88aa多肽片段或HPV16L2 1-200aa多肽片段；编码所述的HPV16L2 1-88aa多肽片段的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：1；编码所述的HPV16L2 1-200aa多肽片段的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：2。

进一步地，编码所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：3；所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：4。

进一步地，该蛋白疫苗有两种形式：一种为HPV16L2Ne -PTD融合蛋白；一种为HPV16L2Ne蛋白和PTD蛋白按等比例混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。 

图1为重组HPV16L2蛋白疫苗基因的结构模式图。

本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：

重组HPV16L2蛋白疫苗的制备方法，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）；制备方法包括如下步骤：