[发明专利]一种适合叶际细菌和真菌PCR扩增的简便、高效DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物领域，主要是针对研究棉花叶际细菌和真菌多样性研究而改进的DNA提取方法。 

技术背景

植物的叶际是一个复杂的生态系统，虽然微生物的生存环境条件严苛，但是植物叶际却有着丰富的微生物多样性。其中存在着许多对植物有益的细菌群落，包括生防细菌、产植物生长激素细菌及固氮菌等。它们通过和植物寄主的互作，改善着叶际微生物的栖居环境。此外，在植物的叶际也存在着大量的有益真菌，它们在在碳素循环和氮素循环以及增强植物的抗病性等方面起着重要作用。目前，大量转基因植物的种植和农药的喷施以及纳米材料的应用，在给农业带来巨大利益的同时，其对生态环境和生物多样性的负面影响也越来越受到人们的关注。叶际微生物作为一种生态学指标在生态稳定与环境安全评价中开始发挥显著的作用。 

叶际微生物的生物多样性和功能受多重因子(如气候因子的变化、植物种类、发育阶段的不同)的影响。因此，这为原位测定叶际微生物生物多样性、揭示叶际微生物生物多样性与生态功能的关系以及植物-微生物的互作关系带来了巨大的挑战。但是分子生物学技术的快速发展，又必定会使叶际微生物生态的研究取得突破性进展。 

基于此，本专利是在研究转Bt棉花对叶际非标靶微生物影响的基础上，建立起适合叶际真菌和细菌PCR扩增的简便、高效的DNA提取方法。 

实验表明，该DNA提取方法能同时满足对棉花叶际固有细菌和真菌的PCR扩增。利用引物338f和518r(能有效扩增细菌16SrRNA V3区)、以及NS1和GCfung(能有效扩增真菌18SrRNA 部分V1和V2区)、NS1和FR1(能有效扩增真菌18SrRNA 的1650bp)都获得了较好的扩增效果。充分说明该提取方法能同时满足对植物叶际固有细菌和真菌的PCR扩增。目前尚无利用该DNA提取方法研究植物叶际微生物多样性的文献报道。 

发明内容

本发明的目的是建立一种简便、高效提取叶际微生物总DNA的提取方法，能同时满足对叶际细菌和真菌进行有效扩增，进行相关的研究。该方法是一种简单、易行而且提取效率较高的DNA提取方法，可以直接用于叶际细菌和真菌的PCR扩增。 

1、棉花叶际微生物的采集处理 

取10g来源于不同棉花植株的叶片样品，用含有少许吐温-80的无菌磷酸缓冲液(pH7.5)经超声波震荡(40KHz)洗涤叶际微生物细胞，最后离心收集菌体。 

2、DNA的提取 

3、16SrDNA V3区与18SrRNA V1和V2区部分的扩增检验 

选用合适的引物PCR扩增细菌16SrDNA和真菌18SrRNA的部分区段，结果表明该方法能同时满足叶际细菌和真菌的PCR扩增。

附图说明

图1是一些棉花叶际DNA提取效果图；图2是利用细菌通用引物338f-518r扩增的效果图；图3是利用真菌通用引物NS1-Gcfung扩增的效果图。 

具体实施方式

本发明所提供的DNA提取方法是在分析棉花叶际真菌和细菌多样性的研究中建立起来的。其具体步骤如下： 

1、叶际微生物的分离和收集： 

每次取10g来源于不同棉花植株的叶片样品，并将其加入盛有300mL无菌的磷酸缓冲液(pH 7.5)中三角瓶中，此后向样品洗涤液中加入8滴浓度为20％的吐温-80溶液。用超声波震荡(40KHz)8min。按着在无菌操作下用镊子取出叶片样品，13,000g离心8分钟收集菌体。 

2、DNA提取： 

将10g油菜叶际收集的菌体沉淀置于盛有0.7g玻璃珠的2ml离心管里，并向其中加1mL DNA提取缓冲液，之后利用Fast prep振荡器在最大速度下振荡45s；向离心管里加300ul 20％SDS，60℃水浴1小时，期间轻轻摇动；之后再加60ul蛋白酶K，37℃温浴30分钟，期间轻轻摇动；在1,0000g离心10min，收集上清液；向上清液中加等体积的酚氯仿抽提，12000g离心8分钟，收集上层水相(重复两次)：将2/3倍体积的异丙醇到上清液中，-20℃静置1.25小时，13,000g离心15分钟，收集沉淀。用预冷的70％乙醇洗两次后，于超净工作台自然晾干，加50μl超纯水溶解DNA沉淀，备用。 

3、以下图片是利用本方法提取的叶际DNA的效果图以及PCR扩增图。