[发明专利]呋喃妥因残留标示物氨基乙内酰脲的单克隆抗体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能检测呋喃妥因残留标示物1-氨基乙内酰脲(AHD)的单克隆抗体，同时还涉及一种能检测呋喃妥因残留标示物1-氨基乙内酰脲(AHD)的单克隆抗体的制备方法，还涉及一种能检测呋喃妥因残留标示物1-氨基乙内酰脲(AHD)的单克隆抗体的用途。 

背景技术

呋喃妥因属于硝基呋喃类药物，具有5-硝基呋喃环的基本结构，是一种广谱抗菌药，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原虫等均有效，曾在水产业中被广泛使用。毒理学试验证明其有致癌、致突变等严重毒性作用，在硝基呋喃类药物中毒性仅次于呋喃西林。欧盟已于1993年禁止呋喃妥因在养殖业中使用，我国发布的193号公告《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》将硝基呋喃类药物列入禁用清单。 

由于呋喃妥因价格便宜、药效快，目前仍有很多水产养殖户违禁使用。我国对硝基呋喃类药物的残留监控形势依然严峻，必须尽快完善筛选检测体系，以保证公众的生命健康安全和促进国内外经济贸易的顺利进行。 

HPLC-MS/MS是目前公认的硝基呋喃类药物药物残留检测的确证手段，对牛奶、蛋类、猪肉、禽肉、及虾肉等样品的检测限可达0.1～0.3μg/kg。虽然该方法的灵敏度和精确度均很高，但需要配备昂贵的仪器和专业技术人员，不适合室外操作及高通量筛选。 

通常用于高通量筛选的免疫学检测方法基于抗和抗体的生物学反应，灵敏度高并且易于操作。该类药物已有的免疫学检测报道均为多克隆抗体。Xu等(2009)未直接报道所用AHD多克隆抗体的IC₅₀值，其所述胶体金检测试纸条方法检测猪尿液中AHD残留的检测限10μg/L，高于MRPL，不能达到零残留检测要求。另外，多克隆抗体虽灵敏度高，但具有个体差异性，不能实现长期连续的标准化生产，给检测技术的标准化建立带来麻烦。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种呋喃妥因残留标示物氨基乙内酰脲的单克隆抗体(能检测呋喃妥因残留标示物1-氨基乙内酰脲(AHD)的单克隆抗体)，该抗 体能特异性识别AHD，与其他类似物无交叉反应。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种呋喃妥因残留标示物氨基乙内酰脲的单克隆抗体(能检测呋喃妥因残留标示物1-氨基乙内酰脲(AHD)的单克隆抗体)的制备方法，该方法是由半抗原AHD衍生物(CPAHD)与牛血清白蛋白偶联制备的免疫原免疫小鼠，经细胞融合与克隆筛选后，获得了能特异性分泌AHD单克隆抗体的细胞株杂交瘤细胞株AHD/3D4，CCTCC NO：C201151。 

本发明的第三个目的是在于提供了一种呋喃妥因残留标示物氨基乙内酰脲的单克隆抗体(能识别呋喃妥因残留标示物AHD)的试剂盒，该试剂盒能广泛应用于动物可食性组织中呋喃妥因的残留检测，准确提供动物可食性组织中AHD的残留量信息。 

本发明的第四个目的是在于提供了一种呋喃妥因残留标示物氨基乙内酰脲的单克隆抗体(能识别呋喃妥因残留标示物AHD)的试剂盒在动物可食性组织中呋喃妥因残留检测中的应用，为动物源性食品中呋喃妥因的残留监控提供了可靠的技术手段。 

本发明通过以下技术方案实现： 

为了实现本发明的任务，发明人制备了一种能识别1-氨基乙内酰脲的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO：C201151的杂交瘤细胞AHD/3D4所分泌的。 

上述杂交瘤细胞AHD/3D4，保藏在位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201151。 

所用的免疫原是由半抗原CPAHD与牛血清白蛋白偶联制备的。 

进一步，本发明提出了一种适用于AHD残留检测的酶联免疫(ELISA)方法，该方法包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的前处理等步骤。 

一种呋喃妥因残留标示物氨基乙内酰脲的单克隆抗体的制备方法，其步骤是： 

A、将半抗原CPAHD与牛血清白蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原； 

B、将半抗原CPAHD与卵清蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到包被原； 

C、利用步骤A的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO：C201151杂交瘤细胞株AHD/3D4所分泌的单克隆抗体； 

D、用步骤B的包被原包被固相载体(如酶标板)； 

E、将待测样品用酸处理，加入苯甲醛超声衍生后，用乙酸乙酯萃取，取乙 酸乙酯层氮气吹干、正己烷净化和样品稀释液重新溶解得到待测物； 

F、对步骤E的待测物进行酶联免疫检测；