[发明专利]一种分离鉴定核苷酰修饰的蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和蛋白质分离鉴定领域。具体而言，本发明涉及一种分离鉴定核苷酰修饰的蛋白质的方法。

背景技术

早在40年前，研究者已发现通过腺苷酰化或尿苷酰化进行的蛋白质翻译后修饰是酶活性调节的机制之一。

例如，在细菌中，氮素的代谢受到PII(GlnB/GlnK)蛋白的调节。PII蛋白在低氮条件下，被尿苷酰化，激活氮调节系统(NtrB/NtrC)，刺激固氮基因的表达，促进谷氨酰胺合成酶(GS)去腺苷酰化。具体而言，PII是一种调节蛋白，它的活性是被PII的一个Tyr残基的尿苷酰化共价修饰所调节的。腺苷酰转移酶复合物(AT)与尿苷酰化的PII结合可引起谷氨酰胺合成酶去腺苷化，激活谷氨酰胺合成酶活性，而AT与脱尿苷酰化的PII结合则可以引起谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化，抑制谷氨酰胺合成酶活性。PII的尿苷酰化和脱尿苷酰化都是由尿苷酰转移酶(uridylyltransferase)催化的。

因此，分离和鉴定核苷酰修饰化的蛋白质，并在此基础上对其修饰过程和功能进行研究，对于研究酶活性和生物过程调节具有非常重要的意义。

直到现在，研究人员在检测腺苷酰和尿苷酰修饰的蛋白质中，仍需应用同位素标记法。然而，同位素标记法存在多种缺点：首先，其不能进行人体药物动力学研究，在动物实验中对实验人员也易产生辐射伤害；其次，随着方法的复杂化，其灵敏度、重现性和回收率受到影响，动物实验前需预先进行药物的同位素标记，试验操作相对复杂；再次，同位素标记后可能会引起药物的生物活性及其在生物体内的动力学行为发生变化。

随着化学生物学的发展，大量的非同位素连接的(非脱氧、脱氧或双脱氧)核苷三磷酸(即(0/d/dd)NTP)被合成，但是它们仅仅被应用于核酸的标记，例如其可用于DNA测序、DNA印迹法(Southern Blot)、RNA印迹法(Northern Blot)以及原位杂交等。然而，本领域中并未将(非脱氧/脱氧/双脱氧)核苷三磷酸用于蛋白质标记、分离和鉴定中。

综上所述，本领域中迫切需要开发出分离、鉴定核苷酰修饰的蛋白质的安全、方便、有效的新方法，从而提供研究蛋白质翻译后修饰过程、核苷酰修饰的蛋白质及其功能的新途径。

发明内容

本发明的主要目的就是为了提供一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的安全、方便、有效的新方法。本发明的另一个目的是为了提供一种与本发明方法相适应的检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的试剂盒。本发明的再一个目的是为了提供X-0/d/ddNTP在检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质或制备相关试剂盒中的用途。

在本发明的第一方面中，提供了一种检测、分离和/或鉴定可被核苷酰修饰的蛋白质的方法，所述方法包括：

(a)提供包含蛋白质的样品；

(b)使得所述样品与包含X-0/d/ddNTP、核苷酰转移酶、核酸酶、KG、ATP和Mg离子的反应体系接触，其中，X为非同位素检测标记物，0/d/ddNTP为非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，X-0/d/ddNTP为连接有非同位素检测标记物的非脱氧、脱氧或双脱氧的UTP、ATP、GTP、CTP或TTP，KG为α-酮戊二酸；

(c)检测、分离和/或鉴定带有非同位素检测标记物的核苷酰修饰的蛋白质。

在本发明的一个实施方式中，若样品中存在可被核苷酰修饰的蛋白质，则步骤(b)中发生如下反应：

其中，X、0/d/ddNTP、X-0/d/ddNTP、KG如权利要求1中所定义，0/d/ddNMP为与反应前的0/d/ddNTP相对应的非脱氧、脱氧或双脱氧的UMP、AMP、GMP、CMP或TMP，蛋白质-X-0/0/d/ddNMP为带有非同位素检测标记物的0/d/ddNMP修饰的蛋白质。

在本发明的另一个实施方式中，所述包含蛋白质的样品选自：新鲜的、冷冻干燥的或固定的细胞、组织、器官、或其分离物或裂解物；合成或半合成的蛋白质样品。

在一个优选例中，所述包含蛋白质的样品是生物样品，优选血样、尿样、细胞或细胞裂解物。

在另一个优选例中，所述样品来自动物、植物或微生物，优选人、大鼠、小鼠、豚鼠、马、牛、猪、羊、拟南芥、百脉根、水稻、棉花、果蝇、大肠杆菌、苜蓿根瘤菌、大豆、苜蓿、布氏杆菌、结核杆菌、小麦或玉米。