[发明专利]一种Oligo dT引物及构建cDNA文库的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种Oligo dT引物，以及基于这种Oligo dT引物进行cDNA文库构建的方法。 

背景技术

基因表达水平的分析，对研究基因功能起着至关重要的作用。基因表达序列分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，是一种快速分析基因表达信息的技术，它通过快速和详细分析成千上万个表达序列标签(Expressed Sequenced Tags，EST)来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组表达信息。SAGE技术与基因芯片一起为目前两种最常见的基因表达谱研究方法。随着第二代测序技术的发展，通过构建cDNA文库，然后利用第二代测序技术的高通量优势对mRNA文库进行测序，进而进行基因表达谱分析的方法在基因表达谱研究中占有越来越重要的地位。 

真核生物的mRNA分子的5’端存在帽子结构，且往往还含有二级结构，因此，若要成功构建5’端cDNA文库(该文库中各分子携带的待测标签来源于5’各mRNA分子的5’端)，必须克服5’端帽子结构和5’端存在的二级结构的影响，难度较大。此外，即使得到5’端cDNA文库，因为mRNA分子5’端GC含量较高，该文库中各分子携带的待测标签与各mRNA分子的对应关系较差，使得这种文库在多种科学研究中的应用难度较高，用于mRNA分子的表达谱分析时得到的结果不准确。还有，构建所得的5’端cDNA文库5’未端表现不足(undellrepresentation)是目前技术的固有限制，且由许多因素引起。其中最重要的一种因素是由逆转录酶的延长过程的随机失效引起的。因为逆转录酶从mRNA的3’移动到5’末端，所以一定百分比的逆转录酶可能从删RNA模板解离，从而引起cDNA合成过早终止。另一种起作用的因素是逆转录酶在mRNA二级结构区域暂停、减缓或停止。还有一种因素是由污染性的RNA酶引入的，如果在由mRNA分子逆转录成双链cDNA分子的过程中，有极微量的污染性RNA酶，那么，部分mRNA分子的5’未端会被污染性的RNA酶降解去除。上述情况对长mRNA分子的影响尤其严重。因此，目前构建cDNA文库的现有技术中，构建3’端cDNA文库是主流。而现有技术中常采用的Oligo dT引物为含有连续的dT序列的单链DNA分子，序列可简写为：5’-(dT)_n-3’，在整个文库的构建过程中仅具有分离纯化mRNA分子，将mRNA分子反转录成双链cDNA的作用，对形成双链cDNA后的后续操作限制较大，能应用的建库方法 单一。 

目前，构建3’端cDNA文库的方法大致如下： 

(1)利用Oligo dT引物将mRNA反转录并合成dscDNA； 

(2)锚定酶(anchoring enzyme，AE)NlaIII酶切dscDNA，收集dscDNA的poly A/T部分与最近的酶切位点之间的片段，得3’-cDNA； 

(3)在3’-cDNA的5’端接上接头1，得含有接头1的cDNA，该接头1为双链DNA分子，包含Mme I酶切识别序列，其3’端含有CATG四碱基突出末端； 

(4)Mme I酶切合有接头1的cDNA，并回收含有接头1的酶切产物； 

(5)在含有接头1的酶切产物的3’端接上接头2，从而获得两端连有不同接头序列的cDNA文库，该接头2为双链DNA分子，其5’端为突出末端，含有两个通用碱基。 

上述方法中的锚定酶为序列特异性的限制性内切酶，当某些mRNA分子上无该锚定酶的酶切位点时，这些mRNA分子在最终的cDNA文库中无法体现；又或者某些mRNA分子上锚定酶的酶切位点不合适，使得后续的IIs型限制性内切酶Mme I无法实现酶切，或者实现Mme I酶切的位置在dscDNA的poly A/T部分，使得这些mRNA分子所形成的cDNA文库分子中包含的特异性序列太短，无法实现与这些mRNA分子特异性的对应。即，上述方法无法保证样品中所有的mRNA分子均能在cDNA文库中得到体现，进而使得后续的基因表达谱分析结果不准确。 

因此需要一种新的Oligo dT引物，该引物适用性广，基于该引物形成的双链cDNA分子对后续操作的限制小，能够应用于多种建库方法中；此外还需要一种新的cDNA文库构建方法，该cDNA文库构建方法能够使样品中所有的mRNA分子在构建的cDNA文库中得到特异性的体现。 

发明内容