[发明专利]一种Oligo dT引物及构建cDNA文库的方法

权利要求书

1.一种Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物为含有连续的dT序列的单链DNA分子，其含有用于切割的识别位点。

2.根据权利要求1所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、脱氧肌苷、硫代磷酸酯键或II s型限制性内切酶识别序列，所述IIs型限制性内切酶识别序列在Oligo dT引物的5’端。

3.根据权利要求2所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物序列为：

5’-(dT)_xU(dT)_y-3’；

或5’-(RERS)-(dT)_z-3’；

或5’-(dT)_α(P-S)(dT)_β-3’；

或5’-(dT)_γ(I)(dT)_δ-3’；

其中，x、y、z、α、β、γ、δ均为自然数，RERS为含有IIs型限制性内切酶识别序列的核苷酸序列，P-S为硫代磷酸酯键，I为脱氧肌苷。

4.根据权利要求2所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物的3’末端为含通用碱基的核苷酸M，M为A或G或C。

5.根据权利要求4所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物的3’末端为两个含通用碱基的核苷酸，从5’端至3’端依次为M和N，N为A或G或C或T或U或I；所述Oligo dT引物序列为：

5’-(dT)_xU(dT)_yMN-3’；

或5’-(RERS)-(dT)_zMN-3’；

或5’-(dT)_α(P-S)(dT)_βMN-3’；

或5’-(dT)_γ(I)(dT)_δMN-3’；

其中，x、y、z、α、β、γ、δ均为自然数，RERS为含有IIs型限制性内切酶识别序列的核苷酸序列，P-S为硫代磷酸酯键，I为脱氧肌苷。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物含有标记物，所述标记物采用生物素、抗原、抗体、受体、配体、多聚组氨酸中的至少一种。

7.一种cDNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.利用Oligo dT引物反转录mRNA，形成第一条cDNA链，得RNA/DNA杂合分子；该Oligo dT引物为含有连续的dT序列的单链DNA分子，其含有用于切割的识别位点；

B.对RNA/DNA杂合分子中的第一条cDNA链进行扩增，得双链cDNA；

C.利用IIs型限制性内切酶酶切双链cDNA，得含mRNA分子3’端对应序列的片段；

D.含mRNA分子3’端对应序列的片段与第一接头分子连接，得cDNA文库。

8.根据权利要求7所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、脱氧肌苷、硫代磷酸酯键或IIs型限制性内切酶识别序列，所述IIs型限制性内切酶识别序列在Oligo dT引物的5’端。

9.根据权利要求8所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯键或脱氧肌苷；所述步骤C包括以下步骤：

C01.切割剂切割双链cDNA，得双链切割片段；

C02.将双链切割片段与第二接头分子连接，得第一连接产物；

C03.利用第一IIs型限制性内切酶酶切第一连接产物，得含mRNA分子3’端对应序列的片段；

所述切割剂用于特异性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯键或脱氧肌苷3’端的第二个磷酸二酯键。