[发明专利]考马斯亮蓝染色液及其染色方法和在蛋白检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质染色领域，更具体地说，涉及考马斯亮蓝染色液及其染色方法和在蛋白检测中的应用。

背景技术

目前，在蛋白质组学研究中的蛋白质染色方法大致有以下四种，考马斯亮蓝染色法、荧光染色法、硝酸银染色法、同位素显色法等。其中，荧光染色以SYPR0试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及昂贵的试剂，未被作为常规方法使用；同位素显色法则存在安全性和操作局限性等问题，也未能被广泛使用；硝酸银染色法是目前公认的除放射性标记以外的一种最为灵敏的蛋白检测方法，可在纳克级水平上检测SDS-PAGE胶上的蛋白质，但是，其步骤繁琐，成本高，对环境的污染严重；更为严重的是，其在脱色过程中所使用的戊二醛等醛类物质会对蛋白质进行不可逆的修饰，严重干扰后期的质谱鉴定工作。因此，在蛋白质组学研究中，更倾向于采用经典的考马斯亮蓝染色法。

经典的考马斯亮蓝染色法具有良好的重复性、极低的染色背景、较高的灵敏度(大约0.5μg/mm²)以及优良的质谱兼容性。特别是经过Neuhoff等人(Neuhoff，V.，Arold，N.，Taube，D.，Ehrhardt W.，Electrophoresis 1988，9，255)的开创性工作之后，发明了改良型考马斯亮蓝染色法，该方法的灵敏度得到了显著提高，可以检测到蛋白质总量约为30纳克的条带，其所使用的考马斯亮蓝染色液的成分如下：2％磷酸、10％硫酸铵、20％甲醇、0.1％考马斯亮蓝G250。随后，在Neuhoff等人的研究基础上，Candiano及其合作者(Giovanni C.，Maurizio B.，Luca M.，Electrophoresis 2004，25，1327-1333)发明了一种被称为Blue Silver的考马斯亮蓝染色方法，该方法能够检测到仅含有10纳克蛋白的条带，灵敏度接近银染法，据称是目前所报道的考马斯亮蓝染色方法中灵敏度最高的一种，其所使用的考马斯亮蓝染色液的成分与Neuhoff等人的研究相比，区别在于增加考马斯亮蓝G250的含量(由0.1％升至0.12％)、磷酸的含量(由2％升至10％)。但这种方法需要在水中脱色很长的时间，使得胶吸水膨大，变得非常脆，极易破裂，不利于后续的研究工作。

因此，需要一种新的考马斯亮蓝染色液和染色方法，能够在保证灵敏度的情况下，以更低的成本实现对SDS-PAGE胶的染色。

发明内容

本发明的目的在于提供一种考马斯亮蓝染色液及其染色方法和在蛋白检测中的应用，旨在保证灵敏度(10ng)的情况下，进一步降低SDS-PAGE胶染色成本，并解决脱色后胶容易破碎的问题。

为了实现发明目的，本发明提供了一种考马斯亮蓝染色液，所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.5％～10％的酸，质量体积浓度为5％～10％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种。

优选的，所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种。

更优选的，所述染色液是包含体积百分浓度为15％～20％的乙醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的磷酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.03％的考马斯亮蓝G250的水溶液。

本发明还提供了一种基于上述任一种考马斯亮蓝染色液的染色方法，包括以下步骤：

A.染色：将SDS-PAGE胶置于考马斯亮蓝染色液中，染色45min以上；

B.脱色：用水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，将染色液冲洗干净即可；

所述考马斯亮蓝染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.5％～10％的酸，质量体积浓度为5％～10％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种；。

其中，在步骤A之前还包括步骤：