[发明专利]一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法，属于发酵工程技术领域。 

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是具有专一清除生物体内的超氧离子，平衡机体的氧自由基，保护人体细胞免受有毒化学物质、幅射、紫外等环境因素破坏，SOD酶在抗衰老，抗辐射性，消炎，抑制肿瘤和癌症，以及自身免疫疾病的治疗方面有重要的作用；目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于食品饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。目前国内的SOD大多是从动物血液中提取的，由于含有各种难以消除的病毒及外源污染，欧盟已于1999年颁布法令，禁止从动物血液中提取的SOD用于人类；而从植物中提取SOD的方法往往受到原材料的制约，且成本较高；因此开发其他更安全、更经济的提取或合成方法取代传统SOD生产方法将是一个趋势。利用工程微生物制备SOD的工艺具有工艺简单，生产成本低，对环境友好等特点，已成为SOD产业化的发展方向；目前日本、加拿大等国家也开始研究采用基因重组等新的生物工程技术来合成SOD；国内已有企业利用生物工程技术来生产SOD，但产量远不能满足日益增长的市场需求，随着人们对超氧化物歧化酶(SOD)逐渐认识并应用，超氧化物歧化酶市场具备较好的机遇。 

发明内容

本发明是为了提供了一种重组大肠杆菌高效表达人源重组超氧化物歧化酶的方法。 

本发明的技术方案是这样实现的： 

本发明为一种重组大肠杆菌高效表达人源重组超氧化物歧化酶的方法；利用大肠杆菌作为菌种，以酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、KHPO₄、(NH₄)₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O、柠檬酸、柠檬酸铁为原料，进行液体深层次发酵生产超氧化物歧化酶，发酵液经管式离心机进行固液分离，得到菌体及发酵液上清液；所得到的菌体再经过均质机破碎，热处理，离心收集上清液，超滤，微滤和喷雾干燥得到粉状超氧化物歧化酶产品；具体包括下述步骤： 

1、菌种及种子液扩大培养 

1.1本发明所用菌种为大肠杆菌BL21(hSOD-pET-28a)重组菌株。 

1.2将大肠杆菌试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的装在3L三角瓶600mL一级种子培养基中(pH 6.8～7.2；灭菌条件：121℃灭菌30min)；250rpm、37±1℃培养12～14小时备用。 

1.3用100L种子罐对菌种进行扩大培养 

将工业级的酵母粉480g，蛋白胨900g，1M磷酸缓冲液(pH＝6.8)6L，生物素24mg，葡萄糖600g分别投入100L种子罐内，用自来水定容到60L；搅拌均匀；然后用蒸汽直接灭菌，115度保温30分钟，再降温至37度，接入按步骤1.2所得的600mL一级种子菌液；在通气量0.6∶1；温度37±1℃；罐压力0.03～0.05MPa的条件下培养6h，得扩大培养的大肠杆菌二级种子液。 

2、用1000L发酵罐发酵生产超氧化物歧化酶