[发明专利]一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法，利用大肠杆菌作为菌种，以酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、KH₂PO₄、(NH₄)₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O、柠檬酸、柠檬酸铁为原料，进行液体深层次发酵生产人源超氧化物歧化酶，其特征在于通过改进发酵方式及原料，实现了人源超氧化物歧化酶的高产率发酵，大大降低人源超氧化物歧化酶的生产成本，具有很好的社会经济效益。

2.根据权利要求1所述的，一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：将大肠杆菌试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的装在3L三角瓶600mL一级种子培养基中(pH6.8～7.2；灭菌条件：121℃灭菌30min)，250rpm、37±1℃培养12～14小时备用。

3.根据权利要求1所述的，一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法，其种子培养液的特征在于：将工业级的酵母粉480g，蛋白胨900g，1M磷酸缓冲液(pH＝6.8)6L，生物素24mg，葡萄糖600g分别投入100L种子罐内，用自来水定容到60L；搅拌均匀；然后用蒸汽直接灭菌，115度保温30分钟，再降温至37℃，接入600mL一级种子菌液；在风量0.6∶1，温度37±1℃，罐压力0.03～0.05MPa的条件下培养6小时，得扩大培养的大肠杆菌二级种子液。

4.根据权利要求1所述的，一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：将工业级的葡萄糖5kg、6.65kg的KH₂PO₄、2kg的(NH4)2HPO4、6kg的MgSO4·7H2O、柠檬酸1.5kg、柠檬酸铁(III)0.05kg分别投入1000L发酵罐内，用自来水定容到500L，搅拌均匀；然后用蒸汽直接灭菌，115度保温30分钟，再降温至37度，灭菌后由28％NH₄OH调整pH到7.0，再添加0.8L的微量元素液；100g的CuSO4·5H₂O、50g的ZnSO₄，接入60L一级种子培养液；在风量1∶0.6～0.8、温度37±1℃、罐压力0.03～0.05MPa的条件下培养，一段时间以后补葡萄糖，到OD₆₀₀达到40左右开始用IPTG诱导，诱导2小时后，向发酵罐中流加微量元素、CuSO₄·5H₂O和ZnSO₄，共诱导10小时，得到发酵液，利用管式离心机将发酵液进行固液分离，得到菌体和发酵液清液，经超声破碎后测得抗氧化歧化酶的酶活21723U/L。

5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌高效表达重组人源超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：2.5mg/L的微量元素为KI、1.5mg/L的MnCl₂·4H₂O、1.5mg/L的CuCl₂·2H₂O、3.0mg/L的H₃BO₃、2.5mg/L的Na₂MoO₄·2H₂O、1.3mg/L的Zn(CH₃COO)₂·2H₂O、盐酸硫铵4.5mg/L。