[发明专利]一种微生物转化黄体酮制备睾酮的工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物、医药技术领域，涉及一种青霉属分枝青霉组菌株发酵转化黄体酮制备睾酮的工艺。特别提供一株人工驯化的青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361，菌株保藏编号为CGMCC No.4824)菌株，以及用该菌株在发酵罐中发酵转化黄体酮制备睾酮的工艺。 

背景技术

睾酮(17a-羟基雄甾-4-烯-3-酮)又称睾丸素、睾丸酮或睾甾酮，是一种雄性激素药物，它对健康及有着重要的影响，具有促进男性性器官的形成、发育、成熟，并对抗雌激素，抑制子宫内膜生长及卵巢垂体功能。促进蛋白质合成代谢、兴奋骨髓造血功能，刺激血细胞的生成。临床用于男性性腺机能减退症、无睾症及隐睾征；妇科疾病，如月经过多、子宫肌瘤、子宫内膜异位症、老年骨质疏松及小儿再生障碍性贫血。还可用其作为制备丙酸酯和苯甲酸酯衍生物的中间体。国内外对睾酮及其衍生物应用已有大量研究，其应用范围日益扩大。 

在甾体药物生产中微生物转化技术一直占据重要地位，美国和日本从二十世纪八十年代开始以植物甾醇为原料微生物转化生产雄甾烯二酮(4AD)，我国天药股份现已掌握这一生产技术，再以此合成甾体药物，从而解决了植物资源有限的原料瓶颈，降低了制造成本，并大大减少了环境污染。 

睾酮的生产方法有两种：一是以薯芋皂甙为原料经过十二步反应得到睾酮；其二是以4AD为原料，经过四步反应得到睾酮。上述方法需要大量的有机溶剂和化工原料，反应复杂，环境污染大，且有的反应要求在无水条件和低温冷冻条件下进行，总收率较低。国内外也进行了微生物转化的研究，目前报到的主要有两种方法：一是雄甾烯二酮为底物微生物氢化转化为睾酮，该方法在国外已实现产业化；其二是以植物甾醇为底物微生物直接转化为睾酮，该方法尚处于实验室阶段。 

本发明涉及以价值比雄甾烯二酮(4AD)低廉的黄体酮通过青霉属分枝青霉组菌株转化制备睾酮的研究，国内外尚未见文献报道。 

发明内容

为了简便、高效、规模化发酵制备睾酮，本发明提供的转化微生物是一株由中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株，菌株保藏编号为CGMCC No.4824，保藏日期为2011年5月2日。 

在本发明青霉菌发酵黄体酮制备睾酮的方法中，青霉菌(Penicillium ramigena，YNCA0361)菌株经过长时间的驯化培养后，可在PDA培养基、察氏培养基、虎红培养基上生长。 

在本发明青霉菌(Penicillium ramigena，YNCA0361)发酵转化黄体酮制备睾酮的方法中，黄体酮的投料量比例为0.1～2％(w/v)；发酵温度25～40℃，通气比0.1～10(v/v)，搅拌速率120～500r/min，发酵时间100h～200h。产物提取过程中添加1～5％(w/v)的Amberlite XAD～16大孔吸附树脂，25～40℃处理2h。 

在本发明青霉菌(Penicillium ramigena，YNCA0361)发酵转化黄体酮制备睾酮的方法中，可以通过全自动发酵罐发酵黄体酮制备睾酮，经过柱层析分离后得到睾酮的单体。 

式1 

本发明中采用的黄体酮比4AD更为廉价，因此该方法比现有采用4AD生产睾酮的方法更为优越。若能得到高转化率的菌株，并易于大规模生产，将具有很好的工业化应用价值。 

附图说明

图1睾酮结构 

图2菌株YNCA0361转化黄体酮的HPLC图谱 

具体实施方式

在本发明实施例中所用的青霉属分枝青霉组(Penicillium ramigena，YNCA0361)发酵各种黄体酮制备睾酮的方法中，发酵步骤是：在发酵罐中接种培养10h后，调整通气比0.1～2％(v/v)；之后根据睾酮含量的动态监测，将发酵温度调整为25～40℃，pH 4～6，搅拌速率250r/min。产物收集步骤为：在发酵罐中添加1～5％(w/v)的Amberlite XAD～16大孔吸附树脂，25～40℃、250r/min处理2h。发酵液经过固液分离所得菌丝体和大孔吸附树脂在乙醇中超声提取6h。提取液减压蒸去乙醇，经正相与反相硅胶色谱分离、减压浓缩、结晶、干燥后获得纯度大于98％睾酮产品。 

实施例1