[发明专利]一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，属生物工程技术领域。

背景技术

国际稀有糖协会(ISRS)对稀有糖的定义为“在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。D-阿洛酮糖(D-Psicose)是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀有糖的一种。D-阿洛酮糖是D-果糖在C3位置的差向异构体，其甜味类似于蔗糖，甜度相当于果糖的70%，而热量值却只有0.007kcal/g，因此被称为零能量甜味剂，同时D-阿洛酮糖还具有改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等功能特性。

D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase，以下简称DTE)家族蛋白可催化D-果糖异构为D-阿洛酮糖，是D-阿洛酮糖生物转化生产的关键酶。由于固定化酶在稳定性、重复使用性、经济成本、特殊工艺需要等方面较游离酶制剂有着显著的优越性，为了更有效地利用各种游离酶制剂，酶的固定化研究也一直受到研究者的重视。而关于DTE家族的固定化研究并不多，目前仅有日本香川大学(Kagawa University)Izumori团队和韩国世宗大学(Sejong University) Oh团队对DTE家族的固定化进行过报道。其中，Izumori团队先后对菊芋假单胞菌(Pseudomonas cichorii)野生菌来源和重组表达的DTE固定化，进行D-阿洛酮糖的生物转化法生产研究，优化后的工艺以Chitopearl beads为载体，通过离子交换结合方法固定重组DTE；Oh团队以离子交换树脂Duolite A568对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 来源重组表达的D-psicose 3-epimerase进行固定化，在硼酸盐存在下，D-阿洛酮糖的转化率达到65%。因此筛选新的树脂进行DTE家族的固定化成为食品从业者的新任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法。

本发明实现目的的技术方案是：

一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，包括下列步骤：

（1）获取酶液：称取R．sphaeroides SK01l发酵菌体，按质量体积比1:10的比例，加入缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.0-8.0)重悬菌体，利用超声波细胞破碎仪处理菌体后，在转速为6000~10000r/min、温度为0~5℃的条件下离心10~30min，收集上清液，此上清液即为D-塔格糖3-差向异构酶液；

（2）离子交换树脂处理：采用313、或D301-Ⅲ离子交换树脂，先用去离子水浸泡胀润、去杂，接着用质量浓度4%NaOH溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，再用质量浓度4%HCl溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，最后用质量浓度4%NaOH溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，用两倍树脂体积的去离子水浸泡，4℃下保存；

（3）固定化：采用先吸附后交联的方法，向处理好的离子交换树脂中加入D-塔格糖3-差向异构酶液，每g树脂加入D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液1-6mL，并加入上述Tris-HCl缓冲液补足6mL，于pH 7.0~8.0、20~40℃吸附6~12h后取出；加入戊二醛溶液至终浓度为0.01%~0.2%，于2~8℃轻轻振荡交联1~5h，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。

固定化酶液的制备

球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides，R．sphaeroides)，定名为R．sphaeroides SK01l，即CCTCC NO.M207185，通过发酵制备菌体（发酵具体条件见ZL200710191380.1）；离心发酵液(10000 g，10 min，4℃)收集菌体，用Tris-HCl缓冲液(50 mM，pH 8.0)洗涤细胞2次即得静息细胞；细胞按质量体积比1:10加入Tris-HCl缓冲液(50 mM，pH 8.0)重悬后超声破碎7 min(300 W，工作1 s，停3 s，冰浴)，离心(15000 g，20min，4℃)后对上清测定DTE活性，即为游离酶活。

游离DTE酶活力测定

取30 μL游离酶上清液，加50 μL 400 g/L D-果糖及120 μL Tris-HCl(50 mM，pH 8.0)缓冲液，50℃反应5 min，立即取出，加热煮沸10 min终止反应，冷却，12000 r/min离心15min后取上清，HPLC检测。