[发明专利]利用固定化运动发酵单胞菌催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物基化学品的生物制造和生物炼制领域，具体地说，是以菊粉和木薯淀粉为原料，利用重组运动发酵单胞菌催化等摩尔浓度菊粉果糖和木薯淀粉葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法。 

【背景技术】

山梨醇是一种用途广泛的化工原料，主要用于甜味剂、润湿剂、调质剂、软化剂等的生产和制备。目前山梨醇的工业生产技术是采用50％的D-葡萄糖浆催化加氢工艺，但是这种化学法生产山梨醇是一个高耗能、回收成本高昂并产生环境污染的工艺。而生物法生产山梨醇主要是利用运动发酵单胞菌周质空间内的葡萄糖果糖氧化还原酶转化果糖和葡萄糖生成，反应过程简单，反应条件温和，无需高压设备，节约能源，并且对环境友好。但是果糖和葡萄糖这两种基质相对于产物的价格偏高，因此使用一些廉价的替代原料可以大大降低生物法生产山梨醇的成本。 

菊粉是由一类天然果聚糖的混合物，是由果糖单元通过β-2，1-糖苷键连接而成并以葡萄糖单元终止的碳水化合物，主要存在于菊芋、菊苣等植物的块茎中。目前，菊粉的水解主要是利用菊粉酶，切断菊粉的β-2，1-糖苷键，水解为果糖和葡萄糖。菊粉可以用来生产果糖、乙醇、单细胞蛋白、单细胞油脂、柠檬酸、聚果糖以及其他生物化学产品。而目前木薯淀粉也被广泛用于生产 干乳酸、柠檬酸等产品。利用菊粉、菊芋或者木薯淀粉这些可再生的、廉价的、丰富的生物质原料来生产生物化学品具有良好的优势。 

近年来，利用菊芋或菊粉来生产山梨醇的研究有一些报道。Dong-man等人将菊粉酶和渗透处理的运动发酵单胞菌共固定后催化菊芋和葡萄糖来生产山梨醇。另外鲍杰等人指出利用菊芋的酸水解液加入适量的葡萄糖后，用运动发酵单胞菌催化菊芋水解液可得到山梨醇和葡萄糖酸(专利号200910199317)。但是，这些研究中首先将细胞经过甲苯、十六烷基三甲基溴化铵或金属离子处理后进行催化试验，认为新鲜不经过处理的细胞，在直接催化生产山梨醇和葡萄糖酸是会有大量副产物乙醇产生，且无法进行反复循环利用会影响整个过程的生产效率和生产成本。同时，这些研究获得山梨醇和葡萄糖酸的浓度较低，增加了后续产物分离的成本。我们尝试将新鲜细胞经过固定化来催化高浓度的葡萄糖酸和山梨醇，原料成本低，简化了生产工艺；减少了后续产品分离的成本。 

【发明内容】

本发明目的在于利用商业糖化酶同时水解木薯淀粉和菊粉，在高的菊粉和木薯淀粉底物含量下获得含有等摩尔浓度的果糖和葡萄糖的混合水解液，然后采用固定化的新鲜运动发酵单胞菌催化生产高浓度的葡萄糖酸和山梨醇的方法。 

本发明的构思：从菊粉和木薯淀粉生产高浓度葡萄糖酸和山梨醇的方法，具体地说是首先将木薯淀粉液化，然后降温并调整pH。利用商业糖化酶水解菊粉一定时间后，将液化后的淀粉加入菊粉水解液进行共糖化，以获得含有等摩尔浓度的果糖和葡萄糖的混合水解液。将表达有葡萄糖果糖氧化还原酶 的运动发酵单胞菌进行细胞固定化，然后循环利用固定化的运动发酵单胞菌催化等摩尔浓度的果糖和葡萄糖的混合液生产山梨醇和葡萄糖酸。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种利用固定化运动发酵单胞菌同时催化菊粉果糖和木薯葡萄糖生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的方法，其具体步骤为， 

(1)高浓度等摩尔的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法制备； 

首先，将质量浓度为50％的菊粉在60℃、pH 4.0、糖化酶酶量1U/g菊粉的条件下酶解48小时，然后加入已在90℃液化1小时的木薯淀粉(质量分数为50％)，在60℃、pH 4.0的条件下继续水解12小时，获得等摩尔浓度的果糖和葡萄糖的混合水解液。其中菊粉和木薯淀粉的质量比根据菊粉中果聚糖的含量和木薯淀粉中淀粉的含量而定，原则是在充分水解后得到等摩尔浓度的果糖和葡萄糖； 

所述的高浓度等摩尔的菊粉果糖和木薯葡萄糖混合水解液的酶法制备中，用于酶解菊粉的糖化酶是混合型商业糖化酶，该酶液中含有糖化酶和菊粉酶等多种酶蛋白，但是本发明中的酶液不限于商业糖化酶，还包括糖化酶和菊粉酶混合液等； 

(2)重组运动发酵单胞菌的细胞固定化；