[发明专利]用于诊断草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测引物组、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒分子生物学检测领域，具体涉及草鱼呼肠孤病毒不同亚型的三重PCR检测，包括检测引物组、试剂盒及方法。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引起中国、越南、缅甸等亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率可高达60%以上。该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重威胁渔业生产。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60 nm-70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。目前己经报道了近20个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV  JX09-01、GCRV JX09-02、GCRV GD10、GCRV GCRV104株等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。到目前为止，有报道的只有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV GD10已完成全基因组序列分析，而其它毒株只完成了部分节段或者部分序列的测序工作。草鱼呼肠孤病毒比较复杂，不同分离株的各基因节段存在重配和抗原漂移现象，使得目前还没在血清学或者基因型上对其进行亚型分类。但是通过现有的分离株序列信息来看，至少应该有三类，各类的代表株分别是：第一类为873株和JX09-01株，第二类为HZ08株和GD10株，第三类为104株。在相关的研究报道中已有提到将其进行基因分型的探讨,即分别把一、二和三类按照基因序列差异分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。（1、曾伟伟，王庆，刘永奎，等.一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析。水生生物学报,2011.35(5):790-795；2、刘宝芹，曾伟伟，王庆，等.草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及初步应用）。同一亚型的毒株，其对应各节段基因同源性均在95%以上。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有的单独感染，也有混合感染。根据草鱼出血病的流行特点和草鱼呼肠孤病毒分子生物学特性，根据同一亚型不同毒株之间共有的保守序列分别设计引物，建立针对目前已知流行的所有草鱼呼肠孤病毒均能同时作诊断，并且可以鉴定其亚型的三重RT-PCR快速、特异检测技术。

病毒分离、电镜观察、核酸带型分析至今仍是检测草鱼呼肠孤病毒普遍采用的方法，但这些方法操作比较复杂，不能对病毒进行快速诊断，不利于草鱼出血病及时有效防制。聚合酶链式反应（PCR）可以在数小时内对某片段基因进行扩大数百万倍。该技术特异性强，敏感性高、检测快速，已被广泛用于医学、微生物学、兽医学等学科的各领域。多重PCR是一种特殊PCR形式，其最突出特点是一次PCR可同时检测多种基因，尤其适用于病原复杂，基因型较多的病原检测。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测引物组

本发明的另一个目的在于提供一种含有上述引物组的草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测方法。

本发明所采用的技术方案是：

草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测引物组，由以下3对引物组成：

引物对1

P01-F：5' GCC ACC TTT GAG CGC GAG AC 3'(SEQ ID NO：1)；

P01-R：5' GTT AGG GCG GAA AGC ATA CCA GA 3'(SEQ ID NO：2)；

引物对2

P02-F：5' GCT GAT GCT GCA GAC GGC TAA AC 3'(SEQ ID NO：3)；

P02-R：5' TAA TTG CCT GCT GCG CTG ACT 3'(SEQ ID NO：4)；

引物对3

P03-F：5' GGC GGC ATG AAT ATG TAT CGA CT 3'(SEQ ID NO：5)；

P03-R：5' TAT GTG ATT ACG CGG GTC AG 3' (SEQ ID NO：6)。

草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测试剂盒，包括引物液、Tap DNA聚合酶、PCR buffer、dNTP混合物，所述引物液含有上述的引物组（SEQ ID NO1~6）。