[发明专利]用包被抗体的金纳米颗粒检测细菌数量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用包被抗体的金纳米颗粒检测细菌数量的方法。

背景技术

食物和水中大肠杆菌的检测对于食品卫生而言意义重大。我国现行的对于食品中大肠杆菌的检测标准GB 4789.3-2010采用了基于鉴别培养的计数检测法，其中包括大肠菌群MPN计数法以及大肠菌群平板计数法两种检测方法。这两种检测方法均需要相当长的培养时间，如MPN法需4天，平板计数法需3天，因而不适合食品样品，尤其是鲜活产品的快速检测。在快速检测方法方面，目前研究较多的ELISA、免疫磁珠富集、免疫层析等免疫方法以及基于PCR的系列检测法(如旨在快速分析的实时PCR、注重多种细菌同时检测的多重PCR、可区分死菌与活菌的逆转录PCR以及针对表达特定毒素细菌的免疫PCR等)虽然可以缩短检测步骤所需时间，在若干分钟至若干小时之内即可完成样品的分析检测，但其均为基于校准曲线的检测方法，受细菌个体一致性较差的影响，检测限仍然较高。故采用上述方法针对实际样品进行检测时仍需要对样品进行较为复杂的预处理和培养增菌，检测所需总时间依然较长。此外，ELISA等免疫方法及PCR系列方法所使用的试剂或仪器昂贵，检测成本高，不适合大规模推广使用。

因此发现一种灵敏、快速、成本低的检测方法成为研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测待测样品中待测细菌数量的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

I、将包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒与待测样品反应，得到反应液；

II、先用暗场显微镜观察步骤I)得到的反应液，得到暗场散射图像，再将所述暗场散射图像进行图像分析，即得到所述待测样品中的待测细菌数量。

上述方法的步骤II)中，所述图像分析包括如下步骤：

1)将所述暗场散射图像由sRGB色彩空间转换至L*A*B*色彩空间，得到L*A*B*色彩空间图像；

2)将步骤1)得到的L*A*B*色彩空间图像的所有像素进行亮度阈值运算，得到非背景像素和背景像素；

所述亮度阈值运算具体为先设定亮度阈值给定值，再将所述所有像素的亮度值与所述亮度阈值给定值比较，大于所述亮度阈值给定值的像素为非背景像素，小于所述亮度阈值给定值的为背景像素；将所述背景像素设为纯黑色；

3)将步骤2)得到的非背景像素采用八连通的洪泛算法进行分割，得到所有八连通的子区域列表，然后将所述非背景像素间距离小于或等于给定距离r的子区域合并为同一子区域，得到多个包含单一连续形状的子图像；

4)对于每一个步骤3)得的子图像采用色彩比较算法，得到所述子图像中的非背景像素与给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值，提取与任一给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值小于给定的色彩容差阈值的非背景像素像素点为金纳米颗粒通道，然后将所述子图像和所述金纳米颗粒通道分别转换为子图像的二值图像和金纳米颗粒通道二值图像；

所述将所述子图像和所述金纳米颗粒通道分别转换为子图像的二值图像和金纳米颗粒通道二值图像，具体采用的方法为对于所述子图像以及所述金纳米颗粒通道中的每一个像素，将颜色为纯黑色的像素视为0，其它颜色的像素视为1，从而得到相应的二值图像；

5)包括如下步骤：

A)将步骤4)得到的子图像的二值图像用步骤3)所述r值执行r/2次图像膨胀运算，得到整体图像；

上述图像膨胀运算的具体目的为将步骤3)得到的子图像中的各个视为连续但并不直接相连的图像部分相连接成为一个连通的整体，以使图像收缩运算的结果能够正确反应步骤3)对于子图像的连续性的设定；

B)将步骤A得到的整体图像进行图像收缩，得到收缩后的子图像的二值图像；

上述图像收缩直至单次收缩操作不将任何非背景像素置为背景像素。图像收缩步骤完成后，无孔洞的图像变换为处于其质心或接近质心的单个像素，而含有孔洞的图象变换为连通的环，环上像素处于所有孔洞和距离它们最近的外边界的中点。

C)采用四连通洪泛算法填充步骤B得到的收缩后子图像的二值图像的背景像素，得到四连通的背景区域列表，从所述四连通的背景区域列表中选出不与所述收缩后子图像的二值图像边缘相通的背景区域，则其边界即对应一个非背景像素组成的环形；

该环形可能为待测细菌的骨架图像；

D)对步骤C得到的每一个环形进行如下a)、b)和c)的处理：

a)计算所述环形的周长、轴比与方位角；

b)对所述环形进行霍夫变换，变换结果的峰值即为所述环形中的直线参数列表；